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毒力减弱的NSP4突变基因、重组质粒与重组牛轮状病毒

阅读：1114发布：2020-07-28

IPRDB可以提供毒力减弱的NSP4突变基因、重组质粒与重组牛轮状病毒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种毒力减弱的NSP4突变基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ？ID？NO.2所示。本发明还公开了一种包含该毒力减弱的NSP4突变基因的重组质粒，还公开了一种包含该毒力减弱的NSP4突变基因的重组牛轮状病毒，构建方法为：将重组质粒与pcDNA3.1-T7RNAP重组质粒共转染恒河猴肾细胞MA104，然后接种野生型牛轮状病毒，利用反向遗传技术拯救变异病毒，即得毒力减弱的重组牛轮状病毒。本发明的重组牛轮状病毒，为国内外首次利用反向遗传技术获得的毒力减弱的BRV病毒株，与传统获得减毒株方法比较，本发明利用反向遗传技术并结合RNA干涉方法，成功获得毒力减弱的牛轮状病毒，为BRV减毒疫苗侯选株的获得提供了快捷途径。，下面是毒力减弱的NSP4突变基因、重组质粒与重组牛轮状病毒专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种毒力减弱的NSP4突变基因，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

2.一种包含毒力减弱的NSP4突变基因的重组质粒，其特征在于：是由毒力减弱的NSP4突变基因与空白质粒pEASY-T3连接构成的，所述毒力减弱的NSP4突变基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

说明书全文

毒力减弱的NSP4突变基因、重组质粒与重组牛轮状病毒

技术领域

[0001] 本发明涉及毒力减弱的NSP4突变基因、重组质粒与重组牛轮状病毒（bovine rotavirus,BRV），及其构建方法，尤其是涉及一种利用反向遗传技术（Reverse Genetics Technology）获得牛轮状病毒减毒株的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

[0002] 牛轮状病毒（BRV）属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，是非细菌性腹泻的主要病原之一。其主要感染1～7日龄的犊牛，具有流行广、发病率高、危害大等特点，现已成为一种世界性疾病。BRV感染后易引起犊牛消化道机能紊乱，可继发细菌性腹泻，进而加重病情，造成犊牛死亡率提高和康复犊牛生产性能下降，严重阻碍养牛业的持续健康发展，给养牛业造成巨大的经济损失。

[0003] 轮状病毒的基因组为双股RNA，分为11个节段，基因组的节段性赋予了该病毒的高变异率，带来了众多的血清型。据研究发现在全球范围内主要的流行毒株为G6血清型，大约占55.7%，G10血清型次之。而轮状病毒（Rotavirus，RV）主要通过消化道感染，抵抗其感染的主要途径是肠道粘膜免疫。通过口服或经肠道免疫RV减毒疫苗，是阻止RV对肠道粘膜上皮细胞感染的最有效方法。早在1973年美国农业部就批准了第一支新生犊牛轮状病毒口服减毒疫苗，随后国外有不同的疫苗问世。到目前为止，国内还没有安全有效的牛轮状病毒减毒疫苗投放市场。尽管现有国外疫苗还存在一些不足之处，但为BRV的防控做出了重要贡献。已有减毒疫苗是通过传代致弱、基因重配或筛选自然弱毒等传统方式获得的，传统的方法筛选毒力致弱毒株耗时、费力、成功率低，而利用反向遗传技术拯救毒力位点变异的重组病毒，将为减毒毒株的获得提供快捷途径。

[0004] 反向遗传技术是指在已知基因序列的基础上，利用现代生物理论与技术，通过改变基因序列创造突变体并研究突变所造成的表型效应的相关技术。其中，在病毒cDNA分子水平上对其进行体外人工操作，如进行基因点突变、缺失、插入、颠换、转位和互补等改造，获得病毒的感染性分子克隆这一研究策略被称为“病毒拯救”技术，其为更精细地研究病毒基因功能及研制疫苗毒种提供了技术支撑。利用反向遗传技术，科学家们已成功地拯救了流感病毒、狂犬病病毒等RNA病毒。

[0005] 自上个世纪九十年代以来，学者们一直致力于建立轮状病毒（RV）的反向遗传操作系统，但由于轮状病毒（RV）为11节段的双链RNA病毒，体外合成11个片段并将其包装成完整病毒粒子非常困难，这一技术瓶颈制约了该技术的应用。直至2006年，Satoshi Komoto等尝试将体外合成的VP4基因正链RNA导入细胞，在辅助病毒作用下产生新的VP4基因突变（中和抗体识别位点变异）的重组RV，利用针对野生型的VP4中和抗体抑制辅助病毒复制的功能，富集并成功获得VP4基因变异的病毒。这是目前为止报道的轮状病毒反向遗传研究的唯一成功例子，但是由于受VP4中和抗体识别位点的限制，该技术体系不适用于拯救VP4其它位点变异及病毒其它基因变异的病毒。

[0006] 研究表明，RV编码的非结构蛋白NSP4(nonstructural protein 4，NSP4)是一种肠毒素，对病毒的复制和毒力非常重要（Ball等，1996），在轮状病毒的致病中发挥重要作2+ 2+
用。它是目前唯一能引起Ca 转运的已知RV蛋白，通过调控胞内Ca 浓度，最终导致腹泻（Ruiz等，2000；Mori Y等,2002）。体外合成的NSP4蛋白及其短肽可引起动物腹泻，临床症状与完整RV强毒相似，但持续时间较短（Zhang等，2000）。人轮状病毒NSP4毒力位点有不同的报道，例如，55-72位氨基酸区可能是毒素功能的关键区（Ewton等，2001），82-169位的不同氨基酸变异后对NSP4的毒力影响很大（Zhang等1998；Pager等，2000）。目前，被普遍接受的人的RV NSP4毒力位点主要是114-135位氨基酸残基。如何通过改变NSP4基因的毒力位点来获得致弱毒株是目前研究的热点问题之一。

[0007] NSP4蛋白属于非结构蛋白，不能通过中和抗体方法富集变异的病毒。本研究利用RNA干扰技术（RNA interference，RNAi）解决了NSP4毒力位点变异的BRV的筛选和富集的问题。RNA干扰是指双链RNA引发的转录后基因沉默机制，它通过21~23bp的双链RNA或发夹状RNA与特异性mRNA的结合导致靶基因的降解，进而导致目的产物表达的下调。

[0008] 本研究通过构建毒力位点变异的NSP4突变基因的转录质粒，在辅助病毒的帮助下，结合反向遗传技术拯救变异病毒；利用可阻断辅助病毒增殖的RNAi，富集并筛选重组突变病毒；动物实验检测结果表明，我们在国内外首次利用反向遗传技术获得毒力减弱的BRV病毒株。

[0009] 参考文献

[0010] [1]Parr RD,Storey SM,Mitchell DM,et al.The rotavirus enterotoxin NSP4directly interacts with the caveolarstructural protein caveolin-1[J].J Virol,2006;80(6):2842-2854.

[0011] [2]Satoshi Komoto,Jun Sasaki,Koki Taniguchi.Reverse genetic system for introduction of site-specificmutations into the double-stranded RNA genome of infectious rotavirus[J].PNAS,2006;103（12）:4646-4651.

[0012] [3]Roner MR,N.I.,Sherry B,Joklik WK.,Construction and characterization of a reovirus doubletemperature-sensitive mutant.Proc.Nat1.Acad.Sci.U.S.A.,1997,94:p.6826-6830.

[0013] [4]Berkova Z.,Crawford S.E.,Crawford,Blutt S.E.,et.al.Expression of Rotavirus NSP4Alters the ActinNetwork Organization through the Actin Remodeling Protein Cofilin[J]..Journal ofvirology,2007;81(7):3545–3553.

[0014] [5]Ball JM,Tian P,Zeng CQ,Morris AP,Estes MK.Age-dependent diarrhea induced by a rotaviralnonstructural glycoprotein[J].Science,1996;272:101-104.[0015] [6]Troupin,C.a,Dehée,A.ab,Schnuriger,A.ab,Vende,P.c,Poncet,D.c,Garbarg-Chenon,A.Rearranged genomicRNA segments offer a new approach to the reverse genetics of rotaviruses.JOURNAL OF VIROLOGY,July2010:6711–6719[0016] [7]Pager CT,Aleander J,Steele AD,et al.Soouth African G4P[6]asymptomatic and symptomatic aneonatal rotavirus strains differ in theirNSP4,VP8,andVP7gene[J].J MedVirol,2000,62(20)：208-216.

[0017] [8]Gadlage MJ,Sparks JS,Beachboard DC,Cox RG,Doyle JD,Stobart CC,Denison MR.Murine hepatitisvirus nonstructural protein 4regulates virus-induced membrane modifications and replication complexfunction.J Virol.2010 Jan;84(1):280-90.

[0018] [9]Zhang M,Zeng C Q Y,Dong Y,et al.Mutations in rotavirus nonst ructural glycoprotein NSP4 areassociated wit h altered virus virulence[J].J Virol,1998,72:3666-3672.

发明内容

[0019] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种利用反向遗传技术获得牛轮状病毒减毒病毒株的方法，同时，也提供了毒力减弱的NSP4突变基因、重组质粒。

[0020] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0021] 一种毒力减弱的NSP4突变基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

[0022] 一种包含毒力减弱的NSP4突变基因的重组质粒，是由毒力减弱的NSP4突变基因与空白质粒pEASY-T3连接构成的，所述毒力减弱的NSP4突变基因的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.2所示。

[0023] 所述的重组质粒的构建方法，步骤如下：

[0024] （1）以常规方法构建的pEASY-T3-NSP4重组质粒为模板，分别在引物RNAi-P1、RNAi-P2和RNAi-P3、RNAi-P4的引导下，进行PCR扩增，扩增结束后于回收所有的PCR产物，然后将二者等量（摩尔数比为1：1）混合并作为新一轮PCR的模板，在引物RNAi-P1和RNAi-P4的引导下，做重叠PCR扩增，扩增结束后，回收所有PCR产物，与pEASY-T3空载体连接，获得了重组质粒AABY-1；

[0025] 所述引物RNAi-P1、RNAi-P2、RNAi-P3和RNAi-P4的核苷酸序列如下：

[0026] RNAi-P1：GGCTTTTAAAAGTTCTGTTCCGAG；

[0027] RNAi-P2：GTGTGTAAAGTACTATCCATTAGAGTGATTACACTCGATG；

[0028] RNAi-P3：GATAGTACTTTACACACGATACTCGAGGATCCAGG；

[0029] RNAi-P4：GGTCACATTAAGACCGTTCCTTCCA；如SEQ ID NO.3、4、5、6所示；

[0030] （2）以重组质粒AABY-1为模板，分别在引物AABY-P1、AABY-P2和AABY-P3、AABY-P4的引导下，进行PCR扩增，扩增结束后回收所有的PCR产物，然后将二者等量（摩尔数比为1：1）混合并作为新一轮PCR的模板，在引物AABY-P1和AABY-P4的引导下，做重叠PCR，扩增结束后，回收所有PCR产物，与pEASY-T3空载体连接，即得到了包含毒力减弱的NSP4突变基因的重组质粒AABY；该重组质粒为由T7启动子驱动的NSP4毒力位点及NSP4-shRNA识别位点双重变异的转录质粒AABY，其中，NSP4-shRNA识别位点的变异区为93-104，由AACAGCACATTG变为GATAGTACTTTA；而毒力位点的变异区位于444-455，由ATGATACGAGCA变为TTAACACGCCCA；

[0031] 所述引物AABY-P1、AABY-P2、AABY-P3和AABY-P4的核苷酸序列如下：

[0032] AABY-P1：GGCTTTTAAAAGTTCTGTTCCGAG；

[0033] AABY-P2：CTACTGGGCGTGTTAACAATTTATCG；

[0034] AABY-P3：GTTAACACGCCCAGTAGACGAAATA；

[0035] AABY-P4：CACATTAAGACCGTTCCTTCCA；如SEQ ID NO.7、8、9、10所示。

[0036] 具体步骤如下：

[0037] （1）以pEASY-T3-NSP4重组质粒为模板，分别在引物RNAi-P1、RNAi-P2、RNAi-P3和RNAi-P4的引导下，进行PCR扩增，反应条件为：94℃5min；94℃ 30s 65℃ 30s 72℃1min，30个循环；72℃8min；反应结束后于1%（质量/体积百分比，单位：g：ml，下同）琼脂糖凝胶上回收所有的PCR产物，作为下一次PCR反应的模板，在引物RNAi-P1和RNAi-P4的引导下，做重叠PCR，反应条件为：94℃5min；94℃30s 55℃30s 72℃1min，30个循环；72℃8min，PCR产物于1%琼脂糖凝胶上回收，与pEASY-T3空载体连接，获得了重组质粒AABY-1；

[0038] （2）以重组质粒AABY-1为模板，分别在引物AABY-P1、AABY-P2和AABY-P3、AABY-P4的引导下，进行PCR扩增，反应条件为：94℃5min；94℃30s 60℃30s 72℃1min，30个循环；72℃8min；反应结束后于1%琼脂糖凝胶上回收所有的PCR产物，作为下一次PCR反应的模板，在引物AABY-P1和AABY-P4的引导下，做重叠PCR，反应条件为：94℃5min；94℃ 30s57℃ 30s 72℃1min，30个循环；72℃8min，PCR产物于1%琼脂糖凝胶上回收，与pEASY-T3空载体连接，即得到了包含毒力减弱的NSP4突变基因的重组质粒AABY。

[0039] 一种毒力减弱的重组牛轮状病毒，是通过以下方法得到的：将上述的重组质粒AABY与常规方法构建的pcDNA3.1-T7RNAP重组质粒共转染恒河猴肾细胞MA104后，接种辅助病毒（野生型病毒），利用反向遗传技术拯救变异病毒，再通过RNAi技术富集和筛选得到。

[0040] 所述毒力减弱的重组牛轮状病毒的构建方法，步骤如下：将上述的重组质粒AABY与pcDNA3.1-T7RNAP重组质粒共转染恒河猴肾细胞MA104，然后接种野生型牛轮状病毒，利用反向遗传技术拯救变异病毒，再通过RNAi技术富集和筛选，即得毒力减弱的重组牛轮状病毒。

[0041] 所述的构建方法，具体步骤为：

[0042] （1）将长满单层的MA104细胞用0.25％（质量/体积百分比，单位：g：ml，下同）胰蛋白酶消化，传至60mm的平皿中,置37℃，5％CO2培养箱培养，待细胞融合度达到90％时，用于转染；

[0043] （2）用Opti-MEM洗1次细胞，在脂质体LipofectamineTM2000的介导下，将构建好的重组质粒AABY与pcDNA3.1-T7RNAP重组质粒共转染MA104细胞，其中，质粒DNA与脂质TM体Lipofectamine 2000的质量比为1：3，转染5h后换正常细胞培养液，转染24h后接种野生型牛轮状病毒，48h后收集混合病毒，利用RNAi技术富集和筛选毒力减弱的重组牛轮状病毒。

[0044] 所述利用RNAi技术富集和筛选毒力减弱的重组牛轮状病毒，方法为：将所收获的混合病毒以10μg/mL浓度的胰酶37℃预处理60min，接种长满单层的NSP4-shRNA细胞，吸附1h后，于未含犊牛血清且胰酶浓度为1μg/mL浓度的DMEM营养液中37℃培养48～76h，收集出现细胞病变的病毒培养液，反复冻融3次后，再次接种长满单层的NSP4-shRNA细胞，如此连续筛选数代后，最终获得稳定的NSP4基因变异的病毒BRV-AABY，即为毒力减弱的重组牛轮状病毒。

[0045] 所述NSP4-shRNA细胞是通过以下方法得到的：

[0046] （1）针对NSP4基因的shRNA重组慢病毒质粒的构建

[0047] 将人工设计并化学合成的NSP4-shRNA-1和NSP4-shRNA-2分别退火后，与慢病毒H1载体经XbaI和AgeI双酶切后回收的12.5kb片段以及经SmaI和AgeI双酶切所获得的1.5kb片段按照如下体系：12.5kb载体片段，100ng；1.5kb载体片段，50ng；shRNA oligo，
50ng；T4DNA连接酶，0.5μL；10×T4DNA连接酶buffr，2μL，补足H2O使体系至20μL，16℃过夜连接；转化大肠杆菌DH5α株感受态细胞，挑选克隆，提取质粒DNA，经PCR鉴定并经测序确认获得了相应的shRNA重组H1载体，用于后续试验。

[0048] 所述NSP4-shRNA-1和NSP4-shRNA-2的序列如下：

[0049] NSP4-shRNA-1：

[0050] TGAACAGCACATTGCACAC TTTTTTGT；

[0051] NSP4-shRNA-2：

[0052] ACAAAAAATGAACAGCACATTGCACAC如SEQ ID NO.11、12所示。

[0053] PCR鉴定阳性重组质粒的方法是以小提质粒为模板，以已知重组阳性质粒及空载体为对照，在引物LT-P1和引物LT-P2的引导下，进行PCR扩增反应，反应条件为：94℃30s；94℃20s 57℃ 20s 68℃ 30s，35个循环；68℃3min，反应结束后对PCR产物进行3%琼脂糖凝胶电泳检测，重组shRNA的质粒PCR扩增结果为300bp片段，空载体的扩增结果为250bp片段。

[0054] 所述引物LT-P1的序列为：5’-TGTCGCTATGTGTTCTGGGA-3’；

[0055] 所述引物LT-P2的序列为：5’-GGTACAGTGCAGGGGAAAGA-3’，如SEQ ID NO.15、16所示。

[0056] （2）shRNA稳定细胞系的建立

[0057] 将长满单层的MA104细胞用0.25％胰蛋白酶消化，传至60mm的平皿中,置37℃，5％CO2培养箱培养，待细胞融合度达到90％时用于转染。用Opti-MEM洗1次细胞，在脂质体LipofectamineTM2000的介导下，将构建好的NSP4-shRNA重组质粒（8ug）转染MA104细胞（DNA：脂质体2000=1：3），待细胞生长至单层后，用0.25%胰蛋白酶消化传代，连续传代5次后利用报告基因GFP、通过流式细胞分选仪进行筛分，将筛选的阳性细胞进行扩增，待细胞长至单层后，用0.25%胰蛋白酶消化传代1次，液氮保存（冻存液成分为：80%DMEM，10%新生牛血清和10%DMSO），获得稳定细胞系NSP4-shRNA。

[0058] 得到毒力减弱的重组牛轮状病毒后，通过PCR产物测序方法鉴定所拯救的NSP4基因变异的病毒，其中，PCR检测使用的引物为：

[0059] P1：5’-GTAATCACTCTAATGGATAGTACTTTA-3’；

[0060] P2：5’-CCATTCTTCTAGTGTTCTAACATC-3’；如SEQ ID NO.17、18所示。

[0061] 本发明的牛轮状病毒减毒病毒株，构建原理是：根据牛轮状病毒NSP4基因序列，设计并构建毒力减弱NSP4突变基因的转录质粒（毒力位点及已知RNAi位点双重变异），与pcDNA3.1-T7RNAP重组质粒共转染恒河猴肾细胞MA104后，接种辅助病毒（野生型病毒），利用反向遗传技术拯救变异病毒，通过可抑制辅助病毒增殖的RNAi稳定细胞系进行富集并筛选阳性重组NSP4基因变异病毒；利用乳鼠感染实验检测所拯救病毒毒力变化，实验结果表明，获得了毒力减弱的BRV病毒株。

[0062] 本发明的毒力减弱的NSP4突变基因，与野生型的NSP4基因（如序列表中SEQ ID NO.1所示）比较，其编码基因包含两处变异，分别为142-153和493-502nt，见序列表中SEQ ID NO.2所示。

[0063] 本发明所设计的可特异性沉默野生型NSP4基因的shRNA所识别序列为TGAACAGCACATTGCACAC，如SEQ ID NO.19所示，合成shRNA序列并构建可特异沉默NSP4基因的重组慢病毒表达载体RNAi-1。将RNAi-1转染MA104细胞，建立可稳定表达沉默NSP4基因RNAi的细胞系NSP4-shRNA。利用NSP4-shRNA稳定细胞系对所拯救的混合病毒进行传代培养，经过数代筛选并富集，通过RT-PCR产物测序方式确认，最终获得了NSP4基因变异的病毒。

[0064] 乳鼠感染实验检测结果表明，我们在国内外首次利用反向遗传技术获得毒力减弱的BRV病毒株。与传统获得减毒株方法比较，本发明利用反向遗传技术并结合RNA干涉方法，成功获得毒力减弱的牛轮状病毒，为BRV减毒疫苗侯选株的获得提供了快捷途径。

附图说明

[0065] 图1为反向遗传技术获得毒力位点变异的牛轮状病毒的技术路线图。

[0066] 图2为Lenti-virus H1载体酶切结果，其中，M:DL marker 15,000；1：SmaI和AgeI双酶切H1载体；2：XbaI和AgeI双酶切H1载体。

[0067] 图3为shRNA重组H1质粒的PCR鉴定结果，其中，M:DL marker 500；1：空载体阴性对照；2：阳性对照；3：LacZ-shRNA；4：NSP4-shRNA。

[0068] 图4为shRNA稳定细胞系的建立，其中A：LacZ-shRNA；B：NSP4-shRNA。

[0069] 图5为shRNA抑制野生型牛轮状病毒所产生的细胞病变结果，A：NSP4-shRNA细胞；B：LacZ-shRNA细胞。

[0070] 图6为shRNA抑制野生型牛轮状病毒增殖滴度的测定结果，A：NSP4-shRNA；B：LacZ-shRNA。

[0071] 图7为变异病毒与野生型病毒的NSP4基因ORF的核酸比对结果，与野生型病毒BRV（NSP4）比较，变异病毒（AABY）的NSP4基因毒力位点（444-455）和RNAi识别位点（93-104）均发生了预期变异。

[0072] 图8为变异病毒与野生型病毒的NSP4基因的氨基酸比对结果，与野生型病毒BRV（NSP4）比较，变异病毒（AABY）的NSP4基因毒力位点处发生了如下变异，即M135L、I136T及A138P。

[0073] 图9为接种BRV后乳鼠是否发生腹泻及其腹泻程度的判断标准，其中，A：黄色水样便；B：肛周粪便污染；C：黄色软大便；D：未见大便。

[0074] 图10为接种病毒后不同实验组发生腹泻乳鼠的比例的比较结果。

具体实施方式

[0075] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的保护范围。

[0076] 下述实施例中无特别说明均为常规方法，所用试剂及药品如无特别说明均为常规试剂。

[0077] 利用反向遗传技术获得毒力位点变异的牛轮状病毒的技术路线，见图1。

[0078] 实施例1：利用反向遗传技术拯救NSP4基因毒力位点变异的牛轮状病毒[0079] 1NSP4-shRNA识别位点变异的重组质粒的构建

[0080] 本实验室已分离获得一株牛轮状病毒G6，并将经鉴定的NSP4基因序列投递至GenBanK中，其编码序列（FJ972713.1）见SEQ ID NO.1，该株牛轮状病毒G6为常规的野生型牛轮状病毒。参照其序列，应用Applied Biosystems公司提供的siRNA设计软件，确定了RNAi的靶基因序列为5’-TGAACAGCACATTGCACAC-3’（如SEQ ID NO.20所示），其在NSP4基因上的识别位点为91-109区。以常规方法构建的pEASY-T3-NSP4重组质粒为模板，分别在引物RNAi-P1、RNAi-P2和RNAi-P3、RNAi-P4（见表1）的引导下，PCR扩增，反应条件如下：94℃5min；94℃30s 65℃30s 72℃1min，30个循环；72℃8min。反应结束后于1%琼脂糖凝胶上回收所有的PCR产物，作为下一次PCR反应的模板，在引物RNAi-P1和RNAi-P4的引导下，做重叠PCR，反应条件如下：94℃5min；94℃30s 55℃30s 72℃1min，30个循环；72℃8min，PCR产物于1%琼脂糖凝胶上回收，回收PCR产物与pEASY-T3空载体连接，获得了靶基因序列变异的重组质粒AABY-1。

[0081] 表1构建NSP4-shRNA识别序列变异重组质粒的引物序列

[0082]

[0083] 2毒力位点及NSP4-shRNA识别位点双重变异的NSP4重组转录质粒的构建[0084] 以重组质粒AABY-1为模板，分别在引物AABY-P1、AABY-P2和AABY-P3、AABY-P4（见表2）的引导下，PCR扩增，反应条件如下：94℃5min；94℃30s 60℃30s 72℃1min，30个循环；72℃8min。反应结束后于1%琼脂糖凝胶上回收所有的PCR产物，作为下一次PCR反应的模板，在引物AABY-P1和AABY-P4的引导下，做重叠PCR，反应条件如下：94℃5min；94℃30s 57℃30s 72℃1min，30个循环；72℃8min，PCR产物于1%琼脂糖凝胶上回收，与pEASY-T3空载体连接，最终构建了由T7启动子驱动的NSP4毒力位点及NSP4-shRNA识别位点双重变异的转录质粒AABY。变异的NSP4基因序列见序列表2，其中NSP4-shRNA识别位点的变异区为93-104，由AACAGCACATTG变为GATAGTACTTTA；而毒力位点的变异区位于
444-455，由ATGATACGAGCA变为TTAACACGCCCA。

[0085] 表2构建双重变异的NSP4重组转录质粒的引物序列

[0086]

[0087] 3反向遗传技术拯救NSP4基因变异的牛轮状病毒

[0088] 将长满单层的MA104细胞用0.25％胰蛋白酶消化，传至60mm的平皿中,置37℃，5％CO2培养箱培养，待细胞融合度达到90％时用于转染。用Opti-MEM洗1次细胞，在脂质TM
体Lipofectamine 2000的介导下，将构建好的AABY质粒与pcDNA3.1-T7RNAP重组质粒共转染MA104细胞（DNA：脂质体2000=1：3），转染5h后换液，转染24h后接种100个TCID50的野生牛轮状病毒G6，48h后收集混合病毒进行纯化。

[0089] 实施例2：拯救病毒的筛选和鉴定

[0090] 1针对NSP4基因的shRNA重组慢病毒质粒的构建

[0091] 将化学合成的NSP4-shRNA-1和NSP4-shRNA-2、LacZ-shRNA-1和LacZ-shRNA-2（见表3，如SEQ ID NO.11、12、13、14所示）分别退火后，与慢病毒H1载体经XbaI和AgeI双酶切后回收的12.5kb以及经SmaI和AgeI双酶切所获得的1.5kb片段（图2）按照如下体系：12.5kb载体片段，100ng；1.5kb载体片段，50ng；shRNAoligo，50ng；T4DNA连接酶，0.5μL；10×T4DNA连接酶buffer，2μL，补足H2O使体系至20μL，16℃过夜连接。转化大肠杆菌DH5α株感受态细胞，挑选克隆，提取质粒DNA，经PCR鉴定并经测序确认获得了相应的shRNA重组H1载体，用于后续试验。

[0092] PCR鉴定阳性重组质粒的方法是以小提质粒为模板，以已知重组阳性质粒及空载体为对照，在引物LT-P1：

[0093] 5’-TGTCGCTATGTGTTCTGGGA-3’

[0094] 和引物LT-P2：

[0095] 5’-GGTACAGTGCAGGGGAAAGA-3’

[0096] 的引导下，反应条件如下：94℃30s；94℃20s 57℃20s 68℃30s，35个循环；68℃3min，反应结束后对PCR产物进行3%琼脂糖凝胶电泳检测，重组shRNA的质粒PCR扩增结果为300bp片段，空载体的扩增结果为250bp片段。结果如图3所示，其中，M:DLmarker500；1：空载体阴性对照；2：阳性对照；3：LacZ-shRNA；4：NSP4-shRNA。

[0097] 表3沉默BRVNSP4基因及对照LacZ基因的shRNA序列

[0098]

[0099] 注：下划线：针对靶序列的正链RNAi序列；斜体下划线：针对靶序列的负链RNAi；黑体字：shRNA中的Loop；U6terminator及其互补序列：TTTTTT/AAAAAA；方框：XbaI酶切位点

[0100] 2 shRNA稳定细胞系的建立

[0101] 将长满单层的MA104细胞用0.25％胰蛋白酶消化，传至60mm的平皿中,置37℃，5％CO2培养箱培养，待细胞融合度达到90％时用于转染。用Opti-MEM洗1次细胞，在脂质TM
体Lipofectamine 2000的介导下，将构建好的NSP4-shRNA重组质粒（8ug）与LacZ-shRNA重组质粒（8ug）分别转染MA104细胞（DNA：脂质体2000=1：3），转染5h后换液，转染36h后观察荧光，待细胞生长至单层后，用0.25%胰蛋白酶消化传代，连续传代5次后利用报告基因GFP、通过流式细胞分选仪进行筛分，将筛选的阳性细胞进行扩增，待细胞长至单层后，用0.25%胰蛋白酶消化传代1次，液氮保存（冻存液成分为：80%DMEM，10%新生牛血清和
10%DMSO），获得稳定细胞系NSP4-shRNA及LacZ-shRNA（图4）。

[0102] 3 shRNA抑制BRV的增殖实验

[0103] 3.1shRNA抑制野生型BRV G6株所引起的细胞病变

[0104] 将长满单层的LacZ-shRNA细胞和NSP4-shRNA细胞接种100个TCID50的G6株病毒液，于37℃，5%CO2条件下吸附1h后，弃去病毒液，更换DMEM维持液继续培养。接种病毒48h后观察细胞病变，与LacZ-shRNA比较，NSP4-shRNA表达的shRNA可明显抑制由BRV病毒所引起的细胞病变，见图5，其中A为NSP4-shRNA细胞，B为LacZ-shRNA细胞。

[0105] 3.2shRNA抑制野生型BRV G6株的增殖

[0106] 将3.1实验中48h后收集的细胞培养上清液用无血清的DMEM做10倍系列稀释，-1 -8 4 4取10 ~10 稀释液备用。将生长良好的MA104细胞以2×10~3×10 个细胞/ml接种到96孔细胞培养板中，24h后弃去培养液，用移液器由最高稀释度开始接种病毒，每个稀释度接种8个孔，每孔100μl。接种病毒的MA104细胞于37℃、5%CO2培养箱中培养，72h后在光镜下观测细胞病变，用Reed Muench方法计算所收集的细胞培养上清液中BRV G6的滴度，结果发现，与LacZ对照相比，针对NSP4基因的shRNA显著降低BRV病毒滴度（图6）。

[0107] 4 NSP4-shRNA筛选并富集NSP4基因变异的牛轮状病毒

[0108] 将实施例1中所收获的混合病毒以10μg/mL浓度的胰酶37℃预处理60min，接种长满单层的NSP4-shRNA细胞，吸附1h后，于未含犊牛血清且胰酶浓度为1μg/mL浓度的DMEM营养液中37℃培养48-76h。收集出现细胞病变的病毒培养液，反复冻融3次后，再次接种长满单层的NSP4-shRNA细胞，如此连续筛选数代后，最终获得NSP4基因变异的病毒BRV-AABY。

[0109] 5 含NSP4基因变异的牛轮状病毒的PCR鉴定

[0110] 将收集的变异病毒BRV-AABY和野生型病毒BRV提取总基因组RNA，按照如下体系进行反转录：MgCl2，2μl；10×RT Buffer1μl；dNTP Mixture1μl；RNAse Inhibitor0.25μl；RNAse Free dH2O 3.75μl；AMV Reverse Transcriptase 0.5μl；RNA模板1μl；
随机引物0.5μl，总体系为10μl。反转录程序如下：30℃10min；42℃30min；99℃5min；
5℃5min。以反转录合成的cDNA为模板，在引物

[0111] P 1：5’-GTAATCACTCTAATGGATAGTACTTTA-3’

[0112] 和引物P2：5’-CCATTCTTCTAGTGTTCTAACATC-3’

[0113] 的引导下，反应条件如下：94℃5min；94℃1min 50℃30s 68℃1min，30个循环；68℃7min。反应结束后对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物约为450bp。回收PCR产物，进行测序，对野生型及变异病毒的序列进行核酸比对（图7），结果表明所获得的变异病毒BRV-AABY在毒力位点（444-455）和RNAi识别位点（93-104）均发生了预期变异。由测定的核苷酸序列推导的氨基酸比对结果见图8，与野生型病毒比较，BRV-AABY的NSP4基因毒力位点处发生了如下变异，即M135L、I136T及A138P。

[0114] 实施例3：变异病毒BRV-AABY的毒力鉴定

[0115] 1BRV-AABY的病毒滴度测定

[0116] 将变异病毒BRV-AABY及野生型BRV反复冻融3次，使病毒粒子充分释放，4℃，-1 -85000r/min离心10～15min，用无血清的DMEM做10倍系列稀释，取10 ～10 稀释液备用。
4 4
将生长良好的MA104细胞以2×10~3×10 个细胞/ml接种到96孔细胞培养板中，24h后弃去培养液，用移液器由最高稀释度开始接种病毒，每个稀释度接种8个孔，每孔100μl。
接种病毒的MA104细胞于37℃、5%CO2培养箱中培养，72h后在光镜下观测细胞病变，用ReedMuench方法计算BRV-AABY及BRV TCID50。

[0117] 2 动物感染性实验

[0118] 出生后3天的清洁级昆明乳鼠33只，随机分为三组（BRV-AABY组、BRV组及对照组），每组11只，三组乳鼠分别与母鼠同养并正常哺乳。BRV-AABY组和BRV组分别经口接5
种含有10TCID50病毒量的培养细胞冻融液，而对照组经口接种正常培养细胞冻融液，实验重复三次。接种后观察乳鼠腹泻情况，统计腹泻乳鼠的数量及腹泻严重程度。腹泻严重程度按大便性状评分而定，评分方法：没有收集到大便1分，棕色成形大便1分，棕色软大便2分，黄色软大便3分，黄色水样便4分，≧2分表示有腹泻，分值越高则腹泻越重。口服野生型BRV后的乳鼠均出现黄色水样便及肛周粪便污染，口服BRV-AABY的乳鼠仅出现松软的黄便，腹泻症状并不明显，而未接种病毒的对照组乳鼠大便正常（图9）。口服野生型BRV的所有乳鼠于病毒接种后48h时均己出现严重腹泻症状，而口服BRV-AABY的乳鼠只有少数出现轻微腹泻症状，发生腹泻乳鼠的比例的比较结果见图10，与野生型BRV比较，NSP4基因变异的BRV-AABY毒力明显减弱（P＜0.01）。

[0119] 上述实验结果表明，我们成功地利用反向遗传技术获得了牛轮状病毒减毒株。

[0120] 尽管上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，本领域技术人员可以较容易地进行一些修改或改进。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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细菌毒力因子及其用途-专利编号CN101711861A	2020-05-13	483
细菌毒力基因-专利编号CN1735689A	2020-05-11	1119
捕食螨毒力测定方法-专利编号CN104165972A	2020-05-12	663
捕食螨毒力测定方法-专利编号CN104165972B	2020-05-11	949
降低细菌的毒力的方法-专利编号CN102883602A	2020-05-11	943
细菌毒力因子及其用途-专利编号CN1922324B	2020-05-13	737
降低细菌的毒力的方法-专利编号CN102883602B	2020-05-12	964
细菌毒力因子及其用途-专利编号CN1922324A	2020-05-12	223
叶螨毒力测定实验装置-专利编号CN108469497A	2020-05-11	271
捕食螨毒力测定装置-专利编号CN204154697U	2020-05-13	1039

毒力减弱的NSP4突变基因、重组质粒与重组牛轮状病毒

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