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同步检测多种益生肠球菌毒力因子和细菌素的GeXP检测试剂盒和检测方法

阅读：1129发布：2020-08-06

IPRDB可以提供同步检测多种益生肠球菌毒力因子和细菌素的GeXP检测试剂盒和检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种同步检测多种益生肠球菌毒力因子和细菌素的GeXP检测方法和检测试剂盒，可以快速、高效地同时检测多种益生肠球菌毒力因子和细菌素，以提高益生肠球菌安全性和益生性评价的准确性。所述试剂盒包括多基因PCR引物、阴性样品和阳性样品，其中所述多基因PCR引物包括如SEQ ID No:1-SEQ ID No:1所示的12对特异性引物。，下面是同步检测多种益生肠球菌毒力因子和细菌素的GeXP检测试剂盒和检测方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种同步检测多种益生肠球菌毒力因子和细菌素的GeXP检测试剂盒，其特征在于，包括多基因PCR引物、阴性样品和阳性样品，其中

所述多基因PCR引物包括如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的用于检测毒力相关基因Acm的引物对1、如SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的用于检测毒力相关基因As的引物对2、如SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示的用于检测毒力相关基因CylA的引物对3、如SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的用于检测毒力相关基因Efafm的引物对4、如SEQ ID No:19和SEQ ID No:10所示的用于检测毒力相关基因GelE的引物对5、如SEQ ID No:11和SEQ ID No:12所示的用于检测毒力相关基因Esp的引物对6、如SEQ ID No:13和SEQ ID No:14所示的用于检测细菌素相关基因EntA的引物对7、如SEQ ID No:15和SEQ ID No:16所示的用于检测细菌素相关基因EntB的引物对8、如SEQ ID No:17和SEQ ID No:18所示的用于检测细菌素相关基因EntL50A的引物对9、如SEQ ID No:19和SEQ ID No:20所示的用于检测细菌素相关基因EntL50B的引物对10、如SEQ ID No:21和SEQ ID No:22所示的用于检测细菌素相关基因EntP的引物对11、和如SEQ ID No:23和SEQ ID No:24所示的用于检测细菌素相关基因EntQ的引物对12。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性样品为大肠杆菌标准株K88ac。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性样品为屎肠球菌TC3、粪肠球菌ATCC51299、屎肠球菌L50和屎肠球菌KE82。

4.如权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述多基因PCR引物还包括通用引物，所述通用引物含有荧光标记。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光标记为CY5荧光标记。

6.用权利要求1-5中所述的任一项试剂盒同步检测多种益生肠球菌毒力因子和细菌素的GeXP检测方法。

说明书全文

同步检测多种益生肠球菌毒力因子和细菌素的GeXP检测试剂

盒和检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种同步检测多种益生肠球菌毒力因子和细菌素的GeXP检测方法。

背景技术

[0002] 我国农业部规定允许作为饲料添加剂的益生肠球菌菌种包括粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和屎肠球菌(Enterococcus Faecium)，同时也作为动物保健品使用。目前，粪肠球菌、屎肠球菌的安全性和益生性检测方法主要是传统的药敏实验、体外抑菌试验及普通PCR技术。传统的药敏实验用菌株对抗生素药片的敏感程度作为判断标准，而体外抑菌试验是以细菌分泌的上清液能否抑制病原菌的生长作为判断依据。这些结果只能宏观评价细菌的抑菌效果，重复性和灵敏度不高，一般只作为辅助手段。现阶段采用最多的还是分子生物学的方法，其主要依赖于PCR技术对某段特异性的基因进行扩增。但普通PCR技术存在一些不足之处：①检测周期长，过程繁琐；②检测灵敏度底、可重复性不高；③检测目的基因过于单一，容易漏检由于外界差异导致的同种不同菌株，不能全面反应该菌株的致病性或益生性。因此，在评价菌株的安全性和益生性时，只有尽可能检测多个特异性基因，才能使鉴定结果更加可信，对菌株的鉴定更加精确。

[0003] GeXP系统用于研究多基因表达定量分析，采用通用引物和多重特异性引物组合相结合引发多重PCR扩增的方法，把多重引物的扩增转化为1对通用引物的扩增，从而达到高通量检测的目的。但是，建立一种同时能检测多个基因的GeXP检测方法和检测试剂盒，关键在于特异性引物的设计。

[0004] 在实现本发明的过程中，本发明人发现现有技术中至少存在以下问题：尚未公开一种同步检测多种益生肠球菌毒力因子和细菌素的GeXP检测方法和检测试剂盒，可以快速、高效地同时检测多种益生肠球菌毒力因子和细菌素，以提高益生肠球菌安全性和益生性评价的准确性。

发明内容

[0005] 鉴于此，本发明提供一种同步检测多种益生肠球菌毒力因子和细菌素的GeXP检测方法和检测试剂盒，可以快速、高效地同时检测多种益生肠球菌毒力因子和细菌素，以提高益生肠球菌安全性和益生性评价的准确性。

[0006] 具体而言，包括以下的技术方案：

[0007] 根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种同步检测多种益生肠球菌毒力因子和细菌素的GeXP检测试剂盒，包括多基因PCR引物、阴性样品和阳性样品，其中[0008] 所述多基因PCR引物包括如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的用于检测毒力相关基因Acm的引物对1、如SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的用于检测毒力相关基因As的引物对2、如SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示的用于检测毒力相关基因CylA的引物对3、如SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的用于检测毒力相关基因Efafm的引物对4、如SEQ ID No:19和SEQ ID No:10所示的用于检测毒力相关基因GelE的引物对5、如SEQ ID No:11和SEQ ID No:12所示的用于检测毒力相关基因Esp的引物对6、如SEQ ID No:13和SEQ ID No:14所示的用于检测细菌素相关基因EntA的引物对7、如SEQ ID No:15和SEQ ID No:16所示的用于检测细菌素相关基因EntB的引物对8、如SEQ ID No:17和SEQ ID No:18所示的用于检测细菌素相关基因EntL50A的引物对9、如SEQ ID No:19和SEQ ID No:20所示的用于检测细菌素相关基因EntL50B的引物对10、如SEQ ID No:21和SEQ ID No:22所示的用于检测细菌素相关基因EntP的引物对11、和如SEQ ID No:23和SEQ ID No:24所示的用于检测细菌素相关基因EntQ的引物对12。

[0009] 优选的，所述阴性样品为大肠杆菌标准株K88ac。

[0010] 优选的，所述阳性样品为屎肠球菌TC3(Enterococcus Faecium TC3)、粪肠球菌ATCC51299(Enterococcus faecalis ATCC51299)、屎肠球菌L50(Enterococcus Faecium L50)和屎肠球菌KE82(Enterococcus Faecium KE82)。

[0011] 所述的阳性样品屎肠球菌TC3(Enterococcus Faecium TC3)含有Efafm基因(文献：熊媛媛.猪源益生肠球菌的分离鉴定和筛选[D].华中农业大学,2010.)；

[0012] 所述的阳性样品粪肠球菌ATCC51299(Enterococcus faecalis ATCC51299)含有CylA、GelE、Esp、Acm、As基因(文献：周娟.青藏高原牦牛和旱獭携带屎肠球菌的菌株特征分析[D].中国疾病预防控制中心,2015.)；

[0013] 所述的阳性样品屎肠球菌L50(Enterococcus Faecium L50)含有EntL50A、EntL50B、EntQ和EntP基因(文献：BAsanta A,Sánchez J,Gómez-Sala B,et al.Antimicrobial activity of Enterococcus Faecium L50,a strain producing enterocins L50(L50A and L50B),P and Q,against beer-spoilage lactic acid bacteria in broth,wort(hopped and unhopped),and alcoholic and non-alcoholic lager beers.Int J FoodMicrobiol.2008Jul31；125(3):293-307.doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2008.04.011.Epub 2008 Apr 30.)；

[0014] 所述的阳性样品屎肠球菌KE82(Enterococcus Faecium KE82)含有EntA和EntB基因(文献：Vandera E,Lianou A,Kakouri A,et al.Enhanced Control of Listeria monocytogenes by Enterococcus Faecium KE82,a Multiple Enterocin-Producing Strain,in Different Milk Environments.J Food Prot.2017 Jan；80(1):74-85.doi:10.4315/0362-028X.JFP-16-082.)。

[0015] 作为本领域公知技术，所述多基因PCR引物还包括通用引物，所述通用引物的序列为：

[0016] F：AGGTGACACTATAGAATA

[0017] R：GTACGACTCACTATAGGGA。

[0018] 优选的，所述通用引物含有荧光标记。

[0019] 更优选的，所述荧光标记为CY5荧光标记。

[0020] 根据本发明的第二个方面，本发明提供了采用上述试剂盒同步检测多种益生肠球菌毒力因子和细菌素的GeXP检测方法。

[0021] 本发明实施例提供的技术方案的有益效果至少包括：

[0022] 本发明针对已知益生肠球菌6种毒力基因和6种细菌素基因，设计特异性引物，按照本发明的方法，可以通过单管反应，一次性快速、高效的同时检测12种基因，而得知检测出样品或环境中是否携带这些毒力相关基因和细菌素基因，其检测覆盖面广，可大大提高益生肠球菌安全性和益生性评价的准确性，对益生肠球菌筛选方面具有重要的意义。

附图说明

[0023] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0024] 图1为实施例的检测结果图，其中横坐标为PCR扩增产物的碱基数，纵坐标为荧光信号值。

具体实施方式

[0025] 为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

[0026] 根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种同步检测多种益生肠球菌毒力因子和细菌素的GeXP检测试剂盒，包括多基因PCR引物、阴性样品和阳性样品，其中[0027] 所述多基因PCR引物包括如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的用于检测毒力相关基因Acm的引物对1、如SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的用于检测毒力相关基因As的引物对2、如SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示的用于检测毒力相关基因CylA的引物对3、如SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的用于检测毒力相关基因Efafm的引物对4、如SEQ ID No:19和SEQ ID No:10所示的用于检测毒力相关基因GelE的引物对5、如SEQ ID No:11和SEQ ID No:12所示的用于检测毒力相关基因Esp的引物对6、如SEQ ID No:13和SEQ ID No:14所示的用于检测细菌素相关基因EntA的引物对7、如SEQ ID No:15和SEQ ID No:16所示的用于检测细菌素相关基因EntB的引物对8、如SEQ ID No:17和SEQ ID No:18所示的用于检测细菌素相关基因EntL50A的引物对9、如SEQ ID No:19和SEQ ID No:20所示的用于检测细菌素相关基因EntL50B的引物对10、如SEQ ID No:21和SEQ ID No:22所示的用于检测细菌素相关基因EntP的引物对11、如SEQ ID No:23和SEQ ID No:24所示的用于检测细菌素相关基因EntQ的引物对12，以及如SEQ ID No:25和SEQ ID No:26所示的作为通用引物的引物对13。

[0028] 优选的，所述阴性样品为大肠杆菌标准株K88ac。

[0029] 优选的，所述阳性样品为屎肠球菌TC3(Enterococcus Faecium TC3)、粪肠球菌ATCC51299(Enterococcus faecalis ATCC51299)、屎肠球菌L50(Enterococcus Faecium L50)和屎肠球菌KE82(Enterococcus Faecium KE82)。

[0030] 所述的阳性样品屎肠球菌TC3(Enterococcus Faecium TC3)含有Efafm基因(文献：熊媛媛.猪源益生肠球菌的分离鉴定和筛选[D].华中农业大学,2010.)；

[0031] 所述的阳性样品粪肠球菌ATCC51299(Enterococcus faecalis ATCC51299)含有CylA、GelE、Esp、Acm、As基因(文献：周娟.青藏高原牦牛和旱獭携带屎肠球菌的菌株特征分析[D].中国疾病预防控制中心,2015.)；

[0032] 所述的阳性样品屎肠球菌L50(Enterococcus Faecium L50)含有EntL50A、EntL50B、EntQ和EntP基因(文献：BAsanta A,Sánchez J,Gómez-Sala B,et al.Antimicrobial activity of Enterococcus Faecium L50,a strain producing enterocins L50(L50A and L50B),P and Q,against beer-spoilage lactic acid bacteria in broth,wort(hopped and unhopped),and alcoholic and non-alcoholic lager beers.Int J FoodMicrobiol.2008Jul31；125(3):293-307.doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2008.04.011.Epub 2008 Apr 30.)；

[0033] 所述的阳性样品屎肠球菌KE82(Enterococcus Faecium KE82)含有EntA和EntB基因(文献：Vandera E,Lianou A,Kakouri A,et al.Enhanced Control of Listeria monocytogenes by Enterococcus Faecium KE82,a Multiple Enterocin-Producing Strain,in Different Milk Environments.J Food Prot.2017 Jan；80(1):74-85.doi:10.4315/0362-028X.JFP-16-082.)。

[0034] 作为本领域公知技术，所述多基因PCR引物还包括通用引物，所述通用引物的序列为：

[0035] F：AGGTGACACTATAGAATA

[0036] R：GTACGACTCACTATAGGGA。

[0037] 优选的，所述通用引物含有荧光标记。

[0038] 更优选的，所述荧光标记为CY5荧光标记。

[0039] 根据本发明的第二个方面，本发明提供了采用上述试剂盒同步检测多种益生肠球菌毒力因子和细菌素的GeXP检测方法。

[0040] 以下实施例中，大肠杆菌标准株K88ac、屎肠球菌TC3(Enterococcus Faecium TC3)、屎肠球菌L50(Enterococcus Faecium L50)和屎肠球菌KE82(Enterococcus Faecium KE82)是由华中农业大学动物科学院微生物免疫实验室赠予；粪肠球菌ATCC51299(Enterococcus faecalis ATCC51299)购自于中国微生物菌种保藏中心；下述实施例中所用的化学试剂均为市售分析纯试剂。

[0041] 实施例1：

[0042] (1)阴性样品制备

[0043] 将大肠杆菌标准株K88ac制成冻干粉，保存于冻干管中。

[0044] (2)阳性样品制备

[0045] 将屎肠球菌TC3(Enterococcus Faecium TC3)菌株制成冻干粉，保存于冻干管中；

[0046] 将粪肠球菌ATCC51299(Enterococcus faecalis ATCC51299)制成冻干粉，保存于冻干管中；

[0047] 将和屎肠球菌L50(Enterococcus Faecium L50)制成冻干粉，保存于冻干管中；

[0048] 将和屎肠球菌KE82(Enterococcus Faecium KE82)制成冻干粉，保存于冻干管中。

[0049] (3)提取基因组DNA

[0050] ①液体菌株培养：将菌株接种于MRS液体培养基中，28℃，140r/min摇床培养24小时。

[0051] ②菌体收集：取1.5ml培养液于离心管中，12000r/min离心1-2min，弃上清，收集菌体。

[0052] ③辅助裂解：加入溶菌酶100μg/ml，100μl，37℃水浴处理1h。

[0053] ④裂解：向每管中加入400μl裂解液，用枪头迅速强烈抽吸，用以悬浮和裂解细菌细胞。

[0054] ⑤接着向每管中加入132μl，5mol/LNaCl，充分混匀后，12000r/min离心10min，除去蛋白质复合物以及细胞壁等残渣。

[0055] ⑥将上清液转移到新的离心管中(体积约550μl)，加入等体积的苯酚，充分混匀后(上下颠倒离心管数次)，12000r/min离心3min，进一步沉淀蛋白质。

[0056] ⑦重复步骤⑥一次(上清液约500μl)，加入等体积苯酚，充分混匀后(上下颠倒离心管数次)，12000r/min离心3min，进一步沉淀蛋白质。

[0057] ⑧离心后的水层(体积约450μl)，加入等体积的氯仿，充分混合后，12000r/min离心3min，去除苯酚。

[0058] ⑨小心取出上清液，用预冷的两倍体积的无水乙醇沉淀，-20℃沉淀过夜，15000r/min，离心15min，弃去上清液。

[0059] ⑩用400μl，70％的乙醇洗涤一次，15000r/min，离心5min，小心倒掉上清，吸干水分。

[0060] 用50μl的无菌超纯水溶解DNA，室温放置15min，放入-20℃冰箱备用。

[0061] 用琼脂糖凝胶电泳检测检测基因组DNA，电泳结束后，取胶板于300nm紫外灯下观察，若发现亮带，则可以进行PCR扩增，若无亮带出现，则重新提取DNA。

[0062] (4)多基因PCR引物的设计与合成

[0063] 以GenBank公布的引物序列为参考，并在NCBI上下载已知序列，使用DNASTAR软件进行序列比对，选取针对各个靶基因高度保守与特异的基因片段，由premier5.0软件了12重特异性引物，并在NCBI上比对验证引物，确保引物的特异性，最后在引物的5’端添加GeXP通用引物(下划线标出的序列)，引物方向均是从5’-3’端，具体如下：

[0064] 检测毒力相关基因Acm(GenBank：AB500102.1)的引物对1，扩增的片段大小约为279bp，

[0065] Acm-F:

[0066] AGGTGACACTATAGAATA TCATTTTGCCAATGTTTTTCATAGC

[0067] Acm-R:

[0068] GTACGACTCACTATAGGGA CTGAACCTCCAGCTTAATGGTTTTC

[0069] 检测毒力相关基因As(GenBank：U91527.1)的引物对2，扩增的片段大小约为323bp：

[0070] As-F:

[0071] AGGTGACACTATAGAATA GAACATAATTCAGCTAATCCAAATG

[0072] As-R:

[0073] GTACGACTCACTATAGGGA TTTCTTTTGCGGCTAAATCTT

[0074] 检测毒力相关基因CylA(GenBank：JQ794947.1)的引物对3，扩增的片段大小约为270bp：

[0075] CylA-F：

[0076] AGGTGACACTATAGAATA TTAAACATTAATATTTTAAACAAAG

[0077] CylA-R：

[0078] GTACGACTCACTATAGGGA TATATGATCCAAGACTCACGTTTAT

[0079] 检测毒力相关的基因Efafm(GenBank：AF042288.1:490-1368)的引物对4，扩增的片段大小约为260bp：

[0080] Efafm-F：

[0081] AGGTGACACTATAGAATA TATGGGAAATCAACACAGAAAGCCA

[0082] Efafm-R：

[0083] GTACGACTCACTATAGGGA TCATGGATTGTTTCGATGTTCCATT

[0084] 检测毒力相关的基因GelE(GenBank：FJ858146.1:3368-4897)的引物对5，扩增的片段大小约为333bp：

[0085] GelE-F：

[0086] AGGTGACACTATAGAATA TGCTTCCTCTTTAGATGTAGTTGGT

[0087] GelE-R：

[0088] GTACGACTCACTATAGGGA CACCGCCTTGATCATAATAAGGCGT

[0089] 检测毒力相关的基因Esp(GenBank：KU351166.1)的引物对6，扩增的片段大小约为285bp：

[0090] Esp-F：

[0091] AGGTGACACTATAGAATA GAAGAAGTATATGATGTTGACACAA

[0092] Esp-R：

[0093] GTACGACTCACTATAGGGA TCAAAACCTGGAGAAACGATT

[0094] 检测细菌素相关的基因EntA(GenBank：AB292463.1:174-371)的引物对7，扩增的片段大小约为203bp：

[0095] EntA-F：

[0096] AGGTGACACTATAGAATA AAAGAGACACAACTTATCTATGG

[0097] EntA-R：

[0098] GTACGACTCACTATAGGGA ACTTCCCTGGAATTGCTCCACCTAA

[0099] 检测细菌素相关的基因EntB(GenBank：AB292464.1:842-1057)的引物对8，扩增的片段大小约为186bp：

[0100] EntB-F：

[0101] AGGTGACACTATAGAATA TGATCACAGAATGCCTAATGAG

[0102] EntB-R：

[0103] GTACGACTCACTATAGGGA AGCCCATGCTAGTGGTCCTT

[0104] 检测细菌素相关的基因EntL50A(GenBank：FJ618564.1:1101-1235)的引物对9，扩增的片段大小约为161bp：

[0105] EntL50A-F：

[0106] AGGTGACACTATAGAATA ATGATTGGAGGAGTTATAT

[0107] EntL50A-R：

[0108] GTACGACTCACTATAGGGA ATTGCCCATCCTTCTCCAATA

[0109] 检测细菌素相关的基因EntL50B(GenBank：FJ618564.1:1255-1386)的引物对10，扩增的片段大小约为131bp：

[0110] EntL50B-F：

[0111] AGGTGACACTATAGAATA TGTTAGTATATGGGAGCAAT

[0112] EntL50B-R：

[0113] GTACGACTCACTATAGGGA GTCCAATAAATTGCATGATT TGT

[0114] 检测细菌素相关的基因EntP(GenBank：FJ161956.1:1-195)的引物对11，扩增的片段大小约为174bp：

[0115] EntP-F：

[0116] AGGTGACACTATAGAATA TTGGTACAAAAGTTGATGCAG

[0117] EntP-R：

[0118] GTACGACTCACTATAGGGA CAAGCCAGAAGCCCAGCCACT

[0119] 检测细菌素相关的基因EntQ(GenBank：DQ832184.1:c259-155)的引物对12，扩增的片段大小约为153bp：

[0120] EntQ-F：

[0121] AGGTGACACTATAGAATA TAAGTGTTTCCTTCGTTATTTACT

[0122] EntQ-R：

[0123] GTACGACTCACTATAGGGA ATGGTATCGCAAAATGGATGACC

[0124] GeXP通用引物如下：

[0125] F：AGGTGACACTATAGAATA

[0126] R：GTACGACTCACTATAGGGA

[0127] (5)PCR的特异性检测

[0128] (5.1)引物1-12的特异性检测

[0129] ①PCR扩增：用引物1-12分别对阴性对照和阳性对照基因组DNA进行PCR扩增，做3个重复。

[0130] 反应体系：20-50μL的反应体系，包括：10×PCR Buffer 2-5μL，10mM dNTP1.6-4μL，5M/μL的TaqE 0.2-0.5uL，引物预混液0.2-0.5μL，模板DNA 0.8-2μL，ddH2O 15-37.5μL。

[0131] 反应程序为：94℃3min；94℃30s、62℃50s、72℃100s，30个循环；72℃7min。

[0132] ②毛细管电泳

[0133] 制备SLS/DSS混合液：取DSS400(分子量内标-400)，加入80倍体积SLS(上样缓冲液，甲酞胺)彻底混匀；在每个样本孔中加入39μL SLS/DSS混合液，将PCR产物进行10-100倍稀释，取稀释后的产物1μL加至样品板，混匀后在每孔加一滴石蜡油覆盖样品，以防甲酰胺氧化和样品蒸发。

[0134] 在缓冲液板与样本板对应孔内，每孔加入3/4体积的分离缓冲液，进行毛细管电泳。毛细管电泳的条件是毛细管升温、温度50℃；变性温度90℃20s；注入样品2.0KV 30s；分离6.0KV 35min。

[0135] 利用GenomelLab GeXP遗传分析检测结果，结果表明，阴性对照没有任何扩增产物。阳性对照扩增结果：

[0136] 粪肠球菌ATCC51299：Acm 279bp；粪肠球菌ATCC51299：As 323bp；粪肠球菌ATCC51299：CylA 270bp；粪肠球菌ATCC51299：GelE 333bp；粪肠球菌ATCC51299：Esp 285bp；屎肠球菌TC3：Efafm 260bp；屎肠球菌KE82：EntA 203bp，屎肠球菌KE82：EntB
186bp；屎肠球菌L50：EntL50A 161bp；屎肠球菌L50：EntL50B 131bp；屎肠球菌L50：EntP
174bp；屎肠球菌L50：EntQ 153bp，说明引物1-12的特异性很好，可特异检出Acm基因、As基因、CylA基因、Efafm基因、GelE基因、Esp基因、EntA基因、EntB基因、EntL50A基因、EntL50B基因、EntP基因、EntQ基因。

[0137] (5.2)多重PCR扩增(XP-PCR)

[0138] ①以阳性对照基因组DNA作为多重PCR反应的模板，将4个阳性对照基因组DNA等比例混合，并用上述12对多基因PCR引物等比例混合，每个引物终浓度为0.2μM，再加入通用引物对，终浓度为1μM，混合均匀为引物预混液。

[0139] 反应体系和反应程序同上述步骤。

[0140] ②毛细血管电泳

[0141] 方法与上述步骤中相同。

[0142] 结果如图1所示，图1中具有12个峰，根据横坐标PCTR扩增产物的碱基数数值大小判断基因，从左到右分别为EntL50B 131bp，EntQ 153bp，EntL50A 161bp，EntP 174bp，EntB 186bp，EntA 203bp，Efafm 260bp，CylA 270bp，Acm 279bp，Esp 285bp，As 323bp，GelE
333bp，阴性对照无任何扩增产物。由此表明，引物混合后对各引物的特异性无影响，可以快速检测粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus Faecium)的6种毒力因子和6种细菌素，并能够准确的评价粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus Faecium)的安全性和益生性。

[0143] (6)引物的灵敏度检测

[0144] 利用紫外分光光度计测定基因组DNA的浓度，并根据基因组DNA的分子量和浓度计算相应的拷贝数。将基因组的浓度稀释成106、105、104、103、102、101拷贝/μL的稀释液。

[0145] 将12对引物等比例混合后，以不同浓度的稀释液为模板，按照上述的方法进行PCR扩增和电泳检测。结果表明：检测Acm灵敏度为10拷贝/μL，检测As灵敏度为10拷贝/μL，检测CylA灵敏度为10拷贝/μL，检测Efafm灵敏度为10拷贝/μL，检测GelE灵敏度为10拷贝/μL，检测Esp灵敏度为10拷贝/μL，检测EntA灵敏度为10拷贝/μL，检测EntB灵敏度为10拷贝/μL，检测EntL50A灵敏度为10拷贝/μL，检测EntL50B灵敏度为10拷贝/μL，检测EntP灵敏度为10拷贝/μL，检测EntQ灵敏度为10拷贝/μL。

[0146] (7)试剂盒的使用方法

[0147] ①实验菌株的处理

[0148] 按照上述(3)的方法提取实验菌株基因组DNA，并保存于-20℃冰箱备用。

[0149] ②阴性对照菌株的处理

[0150] 按照上述(3)的方法提取阴性对照菌株基因组DNA，并保存于-20℃冰箱备用。

[0151] ③阳性对照菌株的处理

[0152] 按照上述(3)的方法提取阳性对照菌株基因组DNA，并保存于-20℃冰箱备用。

[0153] ④PCR扩增：

[0154] 用引物对1-12分别对实验菌株的基因组DNA进行PCR扩增，用大肠杆菌标准株K88ac DNA样品为阴性对照，用屎肠球菌TC3(Enterococcus Faecium TC3)、粪肠球菌ATCC51299(Enterococcus faecalis ATCC51299)、屎肠球菌L50(Enterococcus Faecium L50)、屎肠球菌KE82(Enterococcus Faecium KE82)DNA样品为阳性对照，做3个重复。

[0155] 反应体系和反应程序同上述步骤。

[0156] ⑤毛细血管电泳

[0157] 方法与上述步骤中相同。

[0158] 以上所述仅是为了便于本领域的技术人员理解本发明的技术方案，并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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细菌毒力因子及其用途-专利编号CN101711861A	2020-05-13	484
细菌毒力基因-专利编号CN1735689A	2020-05-11	1122
捕食螨毒力测定方法-专利编号CN104165972A	2020-05-12	663
捕食螨毒力测定方法-专利编号CN104165972B	2020-05-11	950
降低细菌的毒力的方法-专利编号CN102883602A	2020-05-11	944
细菌毒力因子及其用途-专利编号CN1922324B	2020-05-13	737
降低细菌的毒力的方法-专利编号CN102883602B	2020-05-12	964
细菌毒力因子及其用途-专利编号CN1922324A	2020-05-12	223
叶螨毒力测定实验装置-专利编号CN108469497A	2020-05-11	272
捕食螨毒力测定装置-专利编号CN204154697U	2020-05-13	1039

同步检测多种益生肠球菌毒力因子和细菌素的GeXP检测试剂盒和检测方法

同步检测多种益生肠球菌毒力因子和细菌素的GeXP检测试剂

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