大肠杆菌(Escherichia coli)是多样性极高的有机体。除了是正常的 肠道菌群之外，E.coli的菌株还可引起膀胱感染，脑膜炎和腹泻。肠 出血性(Enterohemorrhagic)E.coli包括至少5种E.coli，其能引起从类 似霍乱的腹泻到极端大肠炎的多种症状。每种肠出血性E.coli都具有 一套包括粘合素，侵袭素和/或毒素的特异性毒力因子，其负责引起特 异性的腹泻。
致肠病性(Enteropathogenic)E.coli(EPEC)是世界范围内婴儿腹泻 的最主要原因。EPEC疾病的特征是严重程度不同的水样腹泻，以及 呕吐和通常伴随脱水的发烧。除了在发达国家的日间看护和托儿所中 孤立的爆发之外，EPEC在发展中国家对婴幼儿(＜6个月)也是一种主 要的地方病健康威胁。在世界范围内，EPEC是婴幼儿中最主要的细 菌介导性腹泻的原因，据估计EPEC每天可使数十万儿童致死。
肠出血性E.coli(EHEC)，也称为产志贺氏毒素的E.coli(STEC)或 产细胞毒素的E.coli(VTEC)，能引起比EPEC(肠性大肠炎)更严重的腹 泻，且约占10％的病例，该疾病还可演变成常见的致死性肾脏疾病， 溶血性尿毒症综合征(HUS)。EHEC O157:H7是加拿大和美国最常见的 血清型，并且与食物和水中毒有关(3)。其他血清型的EHEC也在亚洲、 欧洲和南美洲引起了一些更为严重的问题，而北美洲的严重情况略差。 EHEC寄居于牛并引起A/E损伤，但在成年动物中并不引起疾病，相 反却将有机体扩散至环境中。由于相对稀少的EHEC就足以感染人 类，所以这会引起严重的健康问题。
与诸如肠毒素性(enterotoxigenic)E.coli的其他E.coli腹泻不同， 由EHEC和EPEC引起的腹泻并不是由毒素介导的。相反，EPEC和 EHEC结合于肠表面(EPEC结合于小肠，EHEC结合于大肠)并引起了 特征性的组织损伤，成为附着和消失(A/E)损伤(8)。A/E损伤的特点在 于在细菌附着位置上肠刷状缘表面的溶解和上皮微绒毛的丧失(消 失)。一旦发生结合，细菌就位于类似杯状的突出物或基架上。在上皮 细胞中支撑这一基架的是几种细胞骨架成分，包括肌动蛋白和与肌动 蛋白相连的细胞骨架蛋白。A/E损伤的形成和在附着细菌下方的富含 肌动蛋白的基架是A/E病原体的组织病理学标志(1，2)。该病理学可在 体外培养的细胞中重现，且基架形成也可通过荧光肌动蛋白染色分析 得以观察(2，11)。A/E损伤的形成可能是破坏所述刷状缘和微绒毛，流 体分泌以及腹泻的原因。
EPEC和EHEC属于A/E病原体家族，其包括若干种在兔子 (REPEC)，猪(PEPEC)和小鼠(Citrobacter rodentium(肠粘膜肥厚症菌)) 中引起疾病的EPEC样动物病原体。这些病原体包括致病岛(PAI)，其 编码特异性的分泌系统并分泌对疾病至关重要的毒力因子。一般认为 形成A/E损伤的基因在单染色体致病岛中是成簇分布的，称为肠上皮 细胞消失座位(LEE)，其包括III型分泌系统(TTSS)，分泌的效应蛋白 及其同源的伴侣蛋白(4-8)。
所述LEE包括41个基因，使其成为更复杂的PAI。所述LEE TTSS 的主要功能是将效应物传递入宿主细胞中，在那里其破坏宿主细胞功 能并介导疾病(9，10，34)。现已鉴定了5种LEE编码的效应物(Tir，EspG， EspF，Map和EspH)(35-40)。(针对易位紧密粘附素(intimin)受体的)Tir 被易位入宿主细胞中，在那里其与宿主细胞骨架蛋白和信号蛋白结合， 并在细菌附着位点启动了肌动蛋白聚合(31，44)，导致了在附着细菌下 方形成了肌动蛋白基架结构，其通过细菌外膜蛋白紧密粘附素与Tir 的细胞外环直接作用。CesT作为Tir稳定和分泌的伴侣蛋白发挥作用 (18，19)。
还对A/E病原体中的四种其他LEE编码的TTSS易位效应物进行 了表征：EspH增强了肌动蛋白基架的延伸(40)；EspF在分解肠上皮细 胞的紧密联合中具有作用(38)；EspG与志贺杆菌微管结合效应物VirA 相关(36，55)；Map位于线粒体(37)，还具有肌动蛋白动力学的作用(48)。 (针对LEE编码的调节子的)Ler是目前已鉴定的仅有的LEE编码的调 节子。
发明概述
本发明部分根据的是对A/E病原体的几种新普通分泌蛋白的鉴定。
在一方面，本发明提供了包括多肽或其片段或变异体，或包括这种 多肽的细胞培养上清液的组合物，其中基本上纯的所述多肽包括与SEQ ID NO：22-43、59或73-84，或其片段或变异体的任意一种或多种序列基 本上相同的氨基酸序列。本发明还提供了包括核酸分子的组合物，其中 所述核酸分子包括与SEQ ID NO：1-21或60-72的任意一种或多种序列基 本上相同的核酸序列；以及包括核酸分子的组合物，其中所述核酸分子 编码与SEQ ID NO：22-43，或其片段的任意一种或多种序列基本上相同的 多肽序列。所述组合物还包括生理可接受的载体，或还包括佐剂。所述 组合物还包括多肽或核酸分子，例如EspA，EspB，EspD，EspP，Tir， 志贺氏毒素1，志贺氏毒素2或紧密粘附素。所述多肽或核酸分子可 能是基本上纯的。
在其他方面，本发明还提供了细菌或其制备方法，其中所述细菌 在诸如nleA，nleB，nleC，nleD，nleE，nleF，nleG或nleH或其同源 物的基因上有突变，或在其基因组上在与SEQ ID NO：1-21或60-72基 本上相同的核酸序列上有突变。在一些实施方案中，所述细菌可以是A/E 病原体，例如肠出血性E.coli(EHEC；例如EHEC O157:H7或EHEC O157:NM)，致肠病性E.coli(EPEC；例如EPEC O127:H6)或Citrobacter rodentium(肠粘膜肥厚症菌)。在某些实施方案中，所述突变可以减弱 毒力，或者所述突变可发生在所述A/E病原体的基因组核酸序列中， 所述核酸序列与选自SEQ ID NO：1-21或60-72的序列基本上相同。所述 细菌可与佐剂一起作为组合物提供。在某些实施方案中，所述细菌可以 是活的。在某些实施方案中，所述细菌可以是死的。给药方式可以是口 服或经肠道外给药。
在其他方面，本发明还提供了在样本中测定A/E病原体存在的方法， 所述方法是通过，提供样本；以及测定以下物质的存在：包括与选自SEQ ID NO：1-21或60-72或其片段或变异体中的任意一种或多种序列基本上 相同的核酸序列的核酸序列；编码与选自SEQ ID NO：22-43、59或73-84， 或其片段或变异体的序列基本上相同的多肽序列的核酸序列，或者包括 与选自SEQ ID NO：22-43、59或73-84，或其片段或变异体的序列基本 上相同的氨基酸序列的多肽，其中所述核酸分子或多肽的存在说明在所 述样本中(例如蛋、粪便、血液或肠)存在有A/E病原体。所述测定包 括用与选自SEQ ID NO：1-21或60-72的序列基本上相同的探针或引物， 或编码与SEQ ID NO：22-43、59或73-84，或其部分基本上相同的多肽的 核酸序列接触所述核酸序列，或者所述方法包括用抗体接触所述氨基酸 序列，所述抗体特异性地结合于选自SEQ ID NO：22-43、59或73-84， 或其片段或变异体的序列。
在其他方面，本发明还通过鉴定动物感染了A/E病原体或具有A/E 病原体感染的风险；以及向所述动物给药有效量的组合物，提供了在 动物(例如，人，反刍动物，例如绵羊(羊属)，山羊，牛(牛属)，等等； 获任一其他动物，例如，猪，兔，家禽(例如，鸭，鸡，火鸡)等等)体 内引起针对A/E病原体或其成分的免疫反应的方法，或降低A/E病原 体集群或扩散的方法，所述组合物包括与SEQ ID NO：22-43、59或73-84 中任意一种或多种序列基本上相同的氨基酸序列的多肽；编码与选自 SEQ ID NO：22-43、59或73-84的序列基本上相同的多肽序列的核酸序列； 包括与SEQ ID NO：1-21或60-72的任意一种或多种序列基本上相同的核 酸序列的核酸分子；或包括这些多肽的细胞培养上清液，由此在所述动 物体内引起免疫反应，或降低所述A/E病原体在所述动物中的集群或扩 散。
在其他方面，本发明还提供了减弱A/E病原体毒力的方法，所述 方法包括在所述A/E病原体中突变诸如nleA，nleB，nleC，nleD，nleE， nleF，nleG或nleH或其同源物中的基因，或在所述A/E病原体基因组 中突变一种或多种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自SEQ ID NO：1-21或60-72，由此减弱毒力。
在其他方面，本发明还提供了筛选减弱A/E病原体毒力的化合物 的方法，所述方法包括提供一个系统(例如，细胞，如EHEC、EPEC 或C.rodentium细胞，动物模型，或体外系统)，该系统包括：包括与 SEQ ID NO：22-43、59或73-84、或其片段或变异体基本上相同的一种或 多种氨基酸序列的多肽；编码与选自SEQ ID NO：22-43、59或73-84，或 其片段或变异体基本上相同的一种或多种序列的核酸序列；或包括与 SEQ ID NO：1-21或60-72或其片段或变异体基本上相同的任意一种或多 种序列的核酸分子；提供测试化合物；及测定所述测试化合物是否调 节所述多肽或核酸分子的表达、分泌或生物活性，其中所述多肽或核 酸分子的改变，例如表达、分泌或生物活性的降低说明该化合物减弱 了A/E病原体的毒力。
在其他方面，本发明还提供了产生A/E病原体毒力因子的方法， 该方法包括提供重组细胞，所述重组细胞包含包括与SEQ ID NO：22-43、59或73-84或其片段或变异体的任一氨基酸序列基本上相同 的多肽；编码与选自SEQ ID NO：22-43、59或73-84或其片段或变异体的 任一氨基酸序列基本上相同的多肽序列的核酸序列；或包括与SEQ ID NO：1-21或60-72或其片段或变异体中任一序列基本上相同的核酸序列的 核酸分子；在允许所述多肽表达和/或分泌的条件下培养所述重组细 胞，且任选地，分离所述多肽。在一些实施方案中，所述多肽可从所 述细胞中分泌出来。
在其他方面，本发明还通过鉴定动物感染了A/E病原体或具有感 染A/E病原体的风险；及向所述动物给药有效量的减弱A/E病原体毒 力的化合物，其中所述化合物抑制包括与SEQ ID NO：22-43、59或73-84 或其片段或变异体中任一序列基本上相同的氨基酸序列的多肽的表达和 分泌，提供了治疗或预防由A/E病原体引起的感染的方法。在一些实 施方案中，所述化合物可以是与SEQ ID NO：1-21或60-72或其片段或 变异体中任一序列基本上相同的核苷酸序列互补的反义核酸分子，或者 是siRNA。
在其他方面，本发明还提供了包括与SEQ ID NO：22-43、59或73-84 的序列基本上相同的氨基酸序列的重组多肽，或包括与SEQ ID NO：1-21 或60-72的序列基本上相同的核酸序列的分离的核酸分子；和/或包括这 些核酸序列的载体；和或包括这些载体的宿主细胞(例如，A/E病原体， 例如肠出血性E.coli(EHEC)，致肠病性E.coli(EPEC)或Citrobacter rodentium。所述载体可以能够整合入A/E病原体的基因组也可以不能整 合入A/E病原体的基因组。
在其他方面，本发明还提供了基于本发明的所述组合物、细菌、多 肽或核酸分子在制备引起针对A/E病原体或其成分产生免疫反应、或 降低在动物中A/E病原体的扩散或集群的药物中的用途。
在其他方面，本发明还提供了包括在样本中测定A/E病原体的试剂 以及教导在样本中测定A/E病原体的包装说明书的试剂盒。所述试剂 包括与选自SEQ ID NO：1-21或60-72或其片段或变异体的任意一种或多 种基本上相同的核酸序列，或编码与SEQ ID NO：22-43、59或73-84，或 其片段或变异体的任意一种或多种基本上相同的多肽的核酸序列基本上 相同的探针或引物探针或引物，或特异性地结合于选自SEQ ID NO：22-43、59或73-84，或其片段或变异体的任意一种或多种序列的抗 体。
“A/E病原体”是一种病原体，例如致病性的E/coli细菌，其可以 结合于动物的肠表面，例如牛、绵羊、山羊、猪、兔、狗、猫等等的动 物，或例如鸡、鸭、火鸡等等的禽类，并引起特征性的组织损伤，称作 附着和消失(A/E)损伤(8)。一般地，A/E致病性感染可导致腹泻，肠性 大肠炎，肾脏疾病(例如溶血性尿毒症综合征)。然而，A/E病原体感染 并不一定会表现出疾病的症状；感染了A/E病原体的宿主动物可以是 该病原体的携带者，并保持健康且未罹患疾病。因此，感染了A/E病 原体或具有感染A/E病原体风险的哺乳动物，包括农业动物，例如家 禽，如鸡，火鸡，鸭，或反刍动物，如牛，绵羊，山羊等等，或其他 农业动物，如猪的动物，以及人类都并未表现出疾病的症状，作为感 染了A/E病原体的结果，他们易患有严重的肠疾病。
示例性的A/E病原体包括且不限于肠出血性E.coli(EHEC)(也称 为产志贺氏毒素的E.coli(STEC)或产细胞毒素的E.coli(VTEC))，例如 EHEC血清型O157(例如，EHEC O157:H7，其基因组序列在登录号 为AE005594、AE005595、AP002566、AE005174、NC_002695或 NC_002655)，或0158，05，08，018，026，045，048，052，055，075， 076，078，084，91，0103，0104，0111，0113，0114，0116，0118，0119， 0121，0125，028，0145，0146，0163，0165；致肠病性E.coli(EPEC)； 以及感染小鼠(例如，Citrobacter rodentium)；兔(例如，RDEC-1株， 例如O15：H-)；猪；绵羊；狗和其他动物的致病性E.coli。许多A/E 病原体菌株是可商业获得的，例如，通过美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection，ATCC)，Manassus，VA，美国。还 可以从被感染的个体中分离A/E病原体，例如，通过在补充有头孢克 肟和亚碲酸盐或免疫磁性富集物的山梨醇MacConkey琼脂上直接涂 布，然后在相同的培养基上进行涂布(72，107，108)得以分离。
“蛋白”，“肽”或“多肽”是二种或更多种氨基酸的任意链，包括 自然发生或非自然发生的氨基酸或氨基酸类似物，无论翻译后修饰(例如， 糖基化或磷酸化)的情况。本发明的“氨基酸序列”，“多肽”，“肽”或“蛋 白”可包括具有异常连接、交联和末端帽子，非肽键或其他修饰基团的 多肽或蛋白。这些修饰基团也在本发明范围之内。术语“修饰基团”是 指包括直接附着于所述肽结构(例如，通过共价轭合)的结构，以及那些 间接附着于所述肽结构(例如，通过稳定的非共价连接或通过共价偶联于 其他的氨基酸残基或其模拟物、类似物或衍生物，其可以位于所述核心 肽结构的侧翼)的结构。例如，所述修饰基团可以偶联于肽结构的氨基末 端或羧基末端，或偶联于所述核心结构域侧翼的肽或肽模拟结构。或者， 所述修饰基团可以轭合于肽结构的至少一个氨基酸残基的侧链，或偶联 于所述核心结构域侧翼的肽或肽模拟区域(例如，通过赖氨酰残基的ε氨 基，通过天冬氨酸残基或谷氨酸残基的羧基，通过酪氨酰残基、丝氨酸 残基或苏氨酸残基的羟基，或在氨基酸侧链上的其他适合的反应基团)。 共价偶联于所述肽结构的修饰基团可通过本领域中公知的方式和方法结 合于连接性化学结构，包括，例如酰胺，烷氨基，氨基甲酸盐或尿素键。
术语“核酸”或“核酸分子”包括了RNA(正链和负链)和DNA，包 括cDNA，基因组DNA和合成的(例如化和合成的)DNA。所述核酸可以 是双链的或单链的。当以单链存在时，所述核酸可以是有义链或反义链。 核酸分子可以是两种或更多种共价结合核苷酸的任意链，包括自然产生 或非自然产生的核苷酸，或核苷酸类似物或衍生物。“RNA”是指两种或 更多种共价结合、自然发生或被修饰的核糖核苷酸的序列。该术语中修 饰RNA的一个例子是磷硫酰RNA。“DNA”是指两种或更多种共价结合、 自然发生或被修饰的脱氧核苷酸的序列。“cDNA”是指通过依赖于RNA 的DNA聚合酶(反转录酶)的反应从RNA模板产生的互补或拷贝DNA。 因此，“cDNA克隆”是指在克隆载体中携带的，互补于感兴趣的RNA 分子的双链DNA序列。“互补”是指两种核酸，例如DNA或RNA，含 有能够形成沃森-克里克碱基对的足够数量的核酸，从而在所述两种核酸 之间形成双链区域。因此，在一条DNA或RNA链中的腺嘌呤与相互补 DNA链中的胸腺嘧啶或相互补RNA链中的尿嘧啶配对。应该理解，核 酸分子中的每一个核苷酸并不必须与相互补链的核苷酸形成匹配的沃森- 克里克碱基对才能形成双链。如果一个核酸分子可与另一个核酸分子在 较严谨的条件下杂交，那么该核酸分子是与另一个核酸分子“互补”的。
在此使用的“细胞培养上清液”一般是指从培养的细菌或其他有机 体(例如，酵母)或细胞(例如，昆虫细胞)中得到的上清液，所述培养物能 够向所述细胞培养基中分泌出含有与SEQ ID NO：22-43、59或73-84或其 片段或变异体中任一序列基本上相同的氨基酸序列的一种或多种多肽。 在一些实施方案中，所述细胞培养上清液是基本上纯的，即，基本上没 有细菌细胞或这些细胞的裂解物。在一些实施方案中，所述细胞培养上 清液可以含有EspA，EspB，EspD，Tir，紧密粘附素(intimin)，志贺 氏毒素1或2，EspP多肽或其片段或集合物。
所述细菌可以是A/E病原体，例如，EHEC，EPEC或Citrobacter rodentium，其在一些实施方案中可以被修饰或突变成主要表达或分泌 此述的蛋白，所述细菌也可以是其他的细菌，例如，非致病细菌，例 如诸如HB101的非致病E.coli，或者非A/E病原体，可通过例如重组 或其他技术对其进行修饰或突变，从而将此述的一种或多种蛋白，例 如，含有与SEQ ID NO：22-43、59或73-84或其片段或变异体中、或其 免疫原性的部分的任一序列基本上相同的氨基酸的多肽分泌到所述细胞 培养基中。在一些实施方案中，所述细菌不是EHEC和EPEC。在一些所 述细菌是A/E病原体的实施方案中，其可以含有进一步的修饰，所述修 饰会削弱其表达或分泌多肽(例如，EspA，EspB，EspD，Tir，紧密粘附 素，志贺氏毒素1或2，或EspP)的能力，所述多肽是在没有所述修饰 时的正常分泌的。在一些实施方案中，可对其他的有机体(例如，酵母) 或细胞(例如，昆虫细胞)进行修饰或突变，例如，通过重组或其他技术， 从而向所述细胞培养基中分泌一种或多种此述的蛋白，例如，含有与SEQ ID NO：22-43，或其免疫原性部分的任一序列基本上相同的氨基酸序列的 多肽。
当某种化合物从其天然伴随成分中分离出来的时候，该化合物是“基 本上纯的”或“分离的”。通常地，当其至少为样本中所述总材料的10％、 20％、30％、40％、50％或60％，或更通常地至少为70％、75％、80％、 85％、90％、95％或99％重量比时，该化合物是基本上纯的。因此，例如， 通过化学合成或重组技术生产的多肽通常基本上不含有其天然结合的成 分。如果通过物理技术，例如离心，沉淀，柱层析，凝胶电泳，HPLC等 等将某种多肽与其天然结合的成分分离，则该多肽一般是基本上纯的。
当某种核酸分子没有与所述编码序列紧邻(即共价连接)时，该核酸分 子通常是基本上纯的或“分离的”，而所述编码序列通常在所述有机体的 自然发生基因组中是相邻的，从所述有机体中得到了本发明的DNA。因 此，“分离的”基因或核酸分子是指并不位于通常在所述基因或核酸分子 (例如在基因组序列中)侧翼，但和/或已完全或部分地从其他转录序列(作 为cDNA或RNA文库)中纯化出来的基因或核酸分子。例如，本发明的 分离的核酸可以是根据自然发生的复杂细胞环境中基本上分离出来的。 在某些情况下，所述分离的材料可以形成部分的组合物(例如，含有其他 物质的粗提取物)，缓冲体系或试剂混合物。在其他情况中，所述材料可 以被纯化成完全均一的状态，正如通过PAGE或诸如HPLC的柱层析测 定的那样。该术语因此包括，例如，整合入载体的重组核酸，例如自我 复制的质粒或病毒；或进入原核生物或真核生物的基因组DNA的核酸， 或以独立于其他序列的分离的分子存在的核酸(例如，通过PCR或限制性 内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)。其还包括了编码其他多 肽序列的部分杂交基因的重组核酸。优选地，分离的核酸包括所有存在 的大分子类型中的至少50％、80％或90％(摩尔比)。因此，分离的基因或 核酸分子可以包括通过化学合成或重组方式得到的基因或核酸分子。包 含于载体中的重组DNA也包括在此述的“分离”定义之内。同样，分离 的核酸分子还包括了异源宿主细胞中的重组DNA分子，以及溶液中部分 或完全纯化的DNA分子。本发明DNA分子的体内和体外RNA转录本 也包括在“分离的”核酸分子之内。这样的分离的核酸分子在制备所编 码的多肽中非常有用，可作为分离同源序列的探针(例如，从其他哺乳动 物种类中)，作为基因定位的探针(例如，通过与染色体的原位杂交)，或 作为测定所述基因在系统中表达的探针(例如，人类组织，例如外周血)， 例如Northern杂交分析。
可以通过例如从天然来源进行提取；通过表达编码多肽化合物的重 组核酸分子；或通过化学合成可得到基本上纯的化合物。可以采用任意 适合的方法进行纯度的分析，例如柱层析，凝胶电泳，HPLC等等。基本 上纯的细胞，例如，细菌细胞的制剂，其中污染的细胞并不具有所希望 的突变基因型，或并未表达或分泌足量所希望的多肽，在所述制剂细胞 中其组成低于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％ 的总数量。
本发明中的各种基因和核酸序列可以是重组序列。术语“重组子” 是指重组的东西，因此当参照核酸构建体进行制备时，该术语是指由结 合到一起或由分子生物学方法制备的核酸序列构成的分子。当参照蛋白 或多肽进行制备时，术语“重组子”是指由分子生物学技术构建的采用 重组核酸构建体进行表达的蛋白或多肽分子。当参照遗传组合物进行制 备时，术语“重组子”是指具有新的在父代基因组中未出现的等位基因 组合的配子和后裔。重组核酸构建体可包括连接于或被操作变为连接于 天然并不连接或天然在不同位点的核酸序列的核苷酸序列。参照作为“重 组子”的核酸构建体可由此说明可使用遗传工程，即通过人工干预对所 述核酸分子进行操作。
可通过转化示例性地将重组核酸构建体引入宿主细胞中。这样的重 组核酸构建体可包括来自所述相同宿主细胞类型或来自不同宿主细胞类 型的序列，其可被分离出来并重新导入所述宿主类型的细胞。作为所述 宿主细胞原始转化的结果，或作为随后的重组和/或修复事件的结果，重 组核酸构建体序列可整合入宿主细胞基因组。
对核酸或蛋白而言，本文所使用的“异源”一词是指通过人工干预 进行操作，使其不处于其天然发现的位置上。例如，可将来自一个物种 的核酸序列引入其他物种的基因组中，或者将来自一个基因座位的核酸 序列移动至相同物种的其他基因座位或染色体外座位。异源蛋白包括， 例如，表达来自异源编码序列的蛋白，或表达来自天然不能表达所述蛋 白的细胞中的重组基因的蛋白。
“基本上相同的”序列是与参考序列相比仅有一个或多个保守性替 换区别的氨基酸或核苷酸序列，正如在本文中所讨论的那样，或在所述 序列位点的一个或多个非保守型替换，缺失或插入并不会破坏所述氨基 酸或核酸分子的生物学功能。这样的序列可以是从10％-90％的任一整数， 或更一般地在所述氨基酸或核苷酸水平与用于比较的序列有至少10％、 20％、30％、40％、50％、55％或60％，或至少65％、75％、80％、85％、 90％或95％，或多至96％、97％、98％或99％的一致，例如，排列程序(96) 或FASTA。对多肽而言，所述比较序列的长度可以是至少2、5、10或 15个氨基酸，或至少20、25或30个氨基酸。在其他实施方案中，所述 比较序列的长度可以是至少35、40或50个氨基酸，或超过60、80或100 个氨基酸。对核酸分子而言，所述比较序列的长度可以是至少5、10、15、 20或25个核苷酸，或是至少30、40或50个核苷酸。在其他实施方案中， 所述比较序列的长度可以是至少60、70、80或90个核苷酸，或超过100、 200或500个核苷酸。可采用公共可获得的序列分析软件(例如，Genetics Computer Group的序列分析软件包，威斯康星大学生物工程中心，1710 大学大道，麦迪逊，Wis.53705，或者是来自于国立医学图书馆的BLAST 软件，或如本文所述的软件)方便地测定序列一致性。可用软件的示例包 括Pile-up和PrettyBox。通过指定对各种替换，缺失，取代和其他修饰的 同源性程度进行比对，这些软件可对类似的序列进行匹配。
可选择地，或除此之外，如果两个核酸序列在较高的严谨条件下能 杂交的话，则这两个核酸序列也是“基本上相同的”。在一些实施方案中， 较高的严谨条件是，例如，能允许与使用至少500个核苷酸长度的DNA 探针，在含有0.5M NaHPO4，pH 7.2，7％SDS，1mM EDTA和1％BSA(组 分V)的缓冲液，在65℃，或在含有48％甲酰胺，4.8×SSC，0.2M Tris-Cl， pH 7.6，1x Denhardt’s溶液，10％硫酸葡聚糖和0.1％SDS的缓冲液，在 42℃条件下的杂交相当的杂交条件(这些是对Northern或Southern杂交的 常见的较高的严谨条件)。杂交实施的时间可以是约20-30分钟，或约2-6 小时，或约10-15小时，或超过24小时或更长。高严谨性的杂交也依赖 于由分子生物学家实施的多种常规技术的成功，例如高保真性的PCR， DNA测序、单链构象多态分析以及原位杂交。与Northern或Southern杂 交不同，这些技术通常是采用相对较短的探针进行的(例如，通常为约16 个核苷酸或更长的序列进行PCR或测定，以及约40个核苷酸或更长的 序列进行原位杂交)。用于这些技术中的所述高严谨条件是分子生物学领 域所属技术人员公知的(61)。
基本上相同的序列可以是，例如，与SEQ ID NO：22-43、59或73-84， 或其片段或变异体的任一序列基本上相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1-21或60-72或其片段或变异体的任一序列基本上相同的核酸序列。 在一些实施方案中，基本上相同的序列可以是，例如，与SEQ ID NO：1-21 或60-72或其片段或变异体的任一序列互补或杂交的核苷酸序列。在一些 实施方案中，基本相同的序列可以源自A/E病原体。
“探针”或“引物”是能与含有互补序列的(所述靶)的另一种DNA 或RNA分子碱基配对的，具有确定序列的单链DNA或RNA分子。所 得杂交分子的稳定性依赖于所发生的碱基配对的程度，并受到诸如所述 探针和靶分子之间互补程度，以及所述杂交条件严谨程度的参数影响。 杂交严谨性的程度受到了诸如温度、盐浓度和诸如甲酰胺的有机分子的 浓度的参数的影响，并可通过本领域所属技术人员公知的方法来确定。 针对此述的核酸序列或其部分的特异性探针或引物可以在至少8个核苷 酸至超过500个核苷酸的整数长度进行变化，包括其中的任一的数值， 依赖于杂交的目的以及进行的条件，可以使用所述探针或引物。例如， 探针或引物可以是至少8、10、15、20或25个核苷酸长度，或者至少30、 40、50或60个核苷酸长度，或可超过100、200、500或1000个核苷酸 长度。针对与此述核酸分子的特异性探针或引物可以是从10％-90％的任 一整数，或更一般地有至少10％、20％、30％、40％、50％、55％或60％， 或至少65％、75％、80％、85％、90％或95％，或多至96％、97％、98％ 或99％地与使用例如排列程序(96)的此述的核酸序列相同。
通过本领域所属技术人员公知的方法，探针或引物可以是具有可检 测性标记的，或者是放射性的或者是非放射性的。探针或引物可用于涉 及核酸杂交的方法，例如核酸测序，通过聚合酶链反应的核酸扩增，单 链构象多态性(SSCP)分析，限制性片段多态性(RFLP)分析，Southern杂 交，Northern杂交，原位杂交，电泳迁移率变动分析(EMSA)，和其他本 领域所属技术人员公知的方法。探针或引物可来自于基因组DNA或 cDNA，例如，通过扩增，或来自克隆的DNA片段，或者是通过化学合 成的。
“突变”包括当与所述父系菌株相比较时，在DNA序列，即有机体 的基因组中的任意改变。所述改变可能是自发产生的，或是通过将所述 有机体暴露于突变性的刺激引起的，例如突变性的化学物质，能量，辐 射，重组技术，交配或其他用来改变DNA的技术。突变可以包括在此述 的任一核苷酸序列中的改变，或者可包括在此述的编码任一所述多肽的 核酸序列中的改变。
当与其父系菌株相比时，如果作为突变的结果，所述突变细胞的毒 力水平降低了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、 90％或100％，那么该突变可以是“减弱毒力”的。当与所述父系菌株比 较时，可以通过测定在所述突变株中至少10％、20％、30％、40％、50％、 60％、70％、80％、90％或100％的多肽表达的降低，例如，包括与SEQ ID NO：22-43、59或73-84，或其片段或变异体的任一序列基本上相同的氨 基酸序列的多肽表达的降低，来测定毒力的降低。可以通过此述的方法 或本领域公知的方法测定A/E病原体的毒力。可以通过测定在所述多肽 的生物学活性至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、 90％或100％的改变，例如，包括与SEQ ID NO：22-43、59或73-84，或 其片段或变异体的任一序列基本上相同的氨基酸序列的多肽生物学活 性，来测定毒力的降低。
“Modulating(调节)”或“Modulates(调节)”是指通过增加或降 低完成的改变。当与对照或参考样本或化合物进行比较时，所述增加或 降低可以是在介于10％至90％之间任一整数的改变，或介于30％至60％ 之间的任一整数，或也可能超过100％。
“检测化合物”是任一的自然发生或人造来源的化合物。检测化合 物可以包括，但不限于，肽、多肽、合成的有机分子，自然发生的有机 分子和核酸分子。检测化合物可以与公知的诸如本文所述的任一多肽或 核酸分子的化合物“竞争”，例如，对毒力的干扰，或对由公知化合物诱 导的任一生物学反应的干扰。
一般地，当与参考化合物相比较时，检测化合物可表现出介于10％ 至200％，或超过500％的任一数值的调节。例如，检测化合物可表现出 至少从10％至200％的任意正整数或负整数的调节，或至少从30％至150％ 的任意正整数或负整数的调节，或至少从60％至100％的任意正整数或负 整数的调节，或任意超过100％的正整数或负整数的调节。相对于公知的 化合物，负调节剂的化合物一般可以降低调节，而与公知的化合物相比， 正调节剂的化合物一般可以升高调节。
“载体”是来自于例如质粒、噬菌体或哺乳动物或昆虫病毒，或人 工染色体的DNA分子，可向其中插入核酸分子，例如，与SEQ ID NO：1-21 或60-72或其片段或变异体的任一序列基本上相同的核酸序列。载体可以 含有一种或多种唯一的限制行位点，或可以在限定的宿主或载体有机体 中自主复制，因此所克隆的序列是可再生的。载体可以是DNA表达载体， 即，能够指导重组多肽合成的任意自主成分，因此可以用来表达多肽， 例如，包括在宿主细胞中的与SEQ ID NO：22-43、59或73-84，或其片段 或变异体的任一序列基本上相同的氨基酸序列的多肽。DNA表达载体包 括细菌质粒和噬菌体、和哺乳动物和昆虫质粒和病毒。载体能够整合入 宿主细胞的基因组中，因此经由所述载体引入所述宿主细胞基因组的任 一修饰都变成了所述宿主细胞的部分基因组。载体也可以不整合入所述 宿主细胞的基因组，因此保持其自主复制单位，例如质粒。
当抗体识别并与抗原，例如，包括与SEQ ID NO：22-43、59或73-84， 或其片段或变异体的任一序列基本上相同的氨基酸序列的多肽结合时， 所述抗体“特异性地结合”于抗原，但基本上不识别和结合样本中的其 他分子。这样的抗体具有例如针对所述抗原的亲和性，其至少10，100， 1000或10000倍高于所述抗体与样本中其他参考分子的亲和性。
“样本”可以是任意从个体中分离的器官，组织，细胞或细胞提取 物，例如从被A/E病原体感染的动物中分离的样本，或给药了本发明的 一种或多种多肽或核酸分子，或其免疫原性片段的动物。例如，样本可 包括，但不限于，从患者(人或动物)、检测个体或实验动物获得的组织(例 如，来自活组织检查或尸检)、细胞、血液、血清、乳汁、尿液、粪便、 唾液、排泄物、蛋、哺乳动物细胞培养物或培养基，或任意其他标本， 或其提取物。样本还可包括，但不限于，通过正常或转化的细胞在细胞 培养中产生的产物(例如，通过重组DNA或单克隆抗体技术)。“样本”还 可以是在实验条件下构建的细胞或细胞系，而不是直接从个体直接分离 得到的。样本还可以是无细胞的，人造来源的或合成的。
可对所述样本进行分析，适用本领域公知的方法和/或此述的方法测 定来自A/E病原体的基因、基因组、多肽、核酸分子的存在，或测定来 自A/E病原体的突变，或测定来自A/E病原体的基因或多肽的表达水平， 或测定来自A/E病原体的基因或多肽的生物学功能。例如，诸如测序、 单链构象多态(SSCP)分析，或对来自样本的PCR产物的限制性片段长度 多态性(RFLP)分析都可用来测定基因中的突变；ELISA或Western杂交 可用来测定多肽或抗体的亲和性水平；Northern杂交可用来测定mRNA 水平，或可用PCR来测定核酸分子的水平。
“免疫反应”包括但不限于，在给药了所述组合物或疫苗之后，一 种或多种动物中的以下反应：抗体的诱导，特异性针对所述组合物或疫 苗的B细胞，T细胞(包括辅助性T细胞，抑制性T细胞，细胞毒性T细 胞，γδT细胞)的诱导。因此针对组合物或疫苗的免疫反应一般包括在 宿主动物中由细胞和/或抗体介导的对所述感兴趣的组合物或疫苗的反应 的发展。一般地，所述免疫反应会导致对A/E病原体产生的感染的预防 和降低；导致对A/E病原体产生的对肠的集群的抵抗；或导致对A/E病 原体产生的扩散的降低。
多肽或核酸分子的“免疫原性片段”是指能够引起免疫反应的氨基 酸或核苷酸序列。因此，免疫原性片段可包括而不限于，此述任意所述 序列的任意部分或与该序列基本上相同的序列，其包括一种或多种抗原 决定簇(被特异性免疫系统细胞，例如T细胞或B细胞识别的位点)。例 如，免疫原性片段可包括但不限于，例如来自此述的一种多种序列的介 于6和60个之间任一数值，或超过60个氨基酸长度的多肽，例如 介于10和20个之间任一数值氨基酸长度的多肽，或介于20和40个氨 基酸长度的多肽。可采用本领域所属技术人员公知的标准方法，例如抗 原决定簇定位技术或采用例如来自Oxford Molecular Group的Omiga 1.0 程序进抗原性或行水疗法作图对这些片段进行鉴定(参见，例如，美国专 利第4,708,871号)(76，77，81，92，73)。
附图的简要描述
图1A-F所示为来自C.rodentium，EPEC和EHEC(SEQ ID NOs：1-3 和22-24)的NleA的核苷酸和氨基酸序列。
图2A-J所示为来自C.rodentium，EPEC和EHEC(SEQ ID NOs：4-7 和25-29和60)的NleB的核苷酸和氨基酸序列。
图3A-F所示为来自C.rodentium，EPEC和EHEC(SEQ ID NOs：8-10 和30-32)的NleC的核苷酸和氨基酸序列。
图4A-F所示为来自C.rodentium，EPEC和EHEC(SEQ ID NOs：11-13 和33-35)的NleD的核苷酸和氨基酸序列。
图5A-H所示为来自C.rodentium，EPEC和EHEC(SEQ ID NOs： 14-17和36-39)的NleE的核苷酸和氨基酸序列。
图6A-H所示为来自C.rodentium，EPEC和EHEC(SEQ ID NOs： 18-21和40-43)的NleF的核苷酸和氨基酸序列。
图7所示为C.rodentium Orf11/GrlA(SEQ ID NO：56)与阳性转录调节 因子，CaiF(SEQ ID NO：57)，以及与未表征的沙门氏菌蛋白(SEQ ID NO：58)的推断的氨基酸序列的氨基酸序列比对。下划线部分是预测的 DNA结合蛋白的螺旋-回转-螺旋基序。*所示为一致的氨基酸残基，而保 守性的改变用+表示。
图8所示为通过来自C.rodentium(pCRorf11)，EHEC(pEHorf11)或 EPEC(pRPorf11)的orf11表现出的C.rodentium Δorf11的互补，以及由C. rodentium ler或orf11表现出的C.rodentium Δler-Δorf11的双突变的互补。
图9所示为在EHEC O157:H7基因组中含有6个新鉴定的效应物基 因的O岛的相对位置的示意图。同样表示出了志贺氏毒素基因(stx)，LEE 和inv-spa TTSS的位置。需要注意的是许多与原噬菌体相关的基因(CP- 933和BP-933)。
图10A-B所示为对EHEC分泌蛋白的蛋白组学分析。A.来自野生型 EHEC(wt)和III型分泌突变体(escN-)总分泌蛋白的1维SDS-PAGE凝胶 电泳。分子量标记的迁移情况如所述凝胶的左侧所示(以kDa为单位)。 B.来自野生型EHEC的总分泌蛋白的2维凝胶电泳。分子量标记的迁移 情况如所述凝胶的左侧所示(以kDa为单位)，大约的pI值如凝胶的顶部 所示。对采用质谱分析的蛋白点(参见表I)进行了圈画和编号。
图11A-C所示为NleA的基因组组织，分布和保守情况。A.在EHEC 基因组中围绕nleA的代表性区域示意图。箭头所指为每个ORF的转录方 向。对ORF的注释来自于对(3)的修饰。将NleA以粗体突出显示。B.对 来自EPEC，EHEC，REPEC，Citrobacter rodentium(Citro.)和非致病性 E.coli菌株HB101的基因组DNA进行的Southern杂交分析。将每个基 因组DNA样本用BamHI(泳道1，4，7，10，13)，EcoRI(泳道2，5，8，11，14)和PstI (泳道3，6，9，12，15)进行消化。C.对来自EHEC，紧密粘附素阳性的原噬 菌体，非O157EHEC菌株(O84:H4)，EPEC和Citrobacter rodentium的 NleA的多重蛋白序列比对。一致的序列由点(.)代表，与特异性序列相比 缺乏的氨基酸由虚线(-)代表。在所述EHEC序列中，将推测的作为跨膜 结构域的两个疏水性部分突出显示。
图12所示为野生型(wt)EHEC和表达pNleA-HA的III型分泌突变体 (escN-)的分泌蛋白(左泳道)，细菌沉淀(右泳道)以及未转化对照的Western 杂交分析。用抗HA(A.)，抗DnaK(B.)，抗Tir(C.)作为探针进行杂交。
图13A-B所示为在ΔnleA EHEC中的III型分泌和易位。A.来自野 生型EHEC(wt)和所述ΔnleA突变体的总分泌蛋白的SDS-PAGE凝胶电 泳。分子量标记的迁移情况如所述凝胶的左侧所示(以kDa为单位)。B.用 抗NleA抗血清对野生型EHEC(wt)和所述ΔnleA突变体的分泌蛋白的 Western杂交分析。分子量标记的迁移情况如所述凝胶的左侧所示(以kDa 为单位)。
图14A-B所示为感染的宿主细胞组分的Western杂交分析。A.用野 生型(wt)或表达HA-标记NleA的escN-EHEC感染HeLa细胞，并通过差 速离心得到亚细胞组分。用于分析的组分有：细菌，未破碎的细胞核细 胞骨架(低速沉淀)，宿主细胞胞液(宿主胞液)，以及宿主细胞膜(宿主细胞 膜)。使用抗HA，抗DnaK，抗钙联接蛋白(Calnexin)和抗微管蛋白(tubulin) 抗体对所述组分进行Western杂交分析。B.将用表达HA-标记NleA的野 生型EHEC感染细胞的膜成分提取出来。然后在冰上在高盐(1M NaCl)， 高pH(pH 11.4)，中性pH和等渗盐(对照)中，或在中性pH和含有1％的 triton x100(Triton X100)的等渗盐中对膜成分进行提取，并且离心从而得 到可溶(S)和不可溶(P)的膜组分。将这些成分用于采用抗HA(顶图)，抗钙 联接蛋白(中图)和抗钙网织蛋白(calreticulin)(底图)抗体的Western杂交分 析。
图15A-D所示为小鼠中Citrobacter rodentium的毒力研究。A.以抗 NleA抗血清为探针，对来自野生型C.rodentium(wt)和所述ΔnleA突变体 的总细菌提取物进行的Western杂交分析。分子量标记的迁移情况如所述 凝胶的左侧所示(以kDa为单位)。B.用野生型C.rodentium(黑色方块)， ΔnleA C.rodentium(空心圆)感染的C3H/HeJ小鼠，以及之前用ΔnleA突 变体感染过且随后用用野生型C.rodentium(垂直小棒)刺激过的小鼠的存 活作图。在感染阶段每天对小鼠进行监测，一旦有任何小鼠变显出濒死 症状立即处死。所示为在每一组中在每一天存活小鼠与起始小鼠数量的 百分比。C.来自被感染的NIH swiss小鼠的结肠C.rodentium的滴度。感 染了野生型C.rodentium(黑色圈)或ΔnleA菌株(空心圆)的小鼠在感染后 10天被处死。将结肠组织和粪便块匀浆并涂布于MacConkey琼脂上从而 测定在处死时所述小鼠结肠中的总C.rodentium负荷。实验中的每一只 小鼠由一个点代表。在图中每一组的平均值由水平的横杠表示。D.测定 被感染的NIH swiss小鼠的大肠和脾脏重量。感染了野生型C.rodentium (黑色方块和三角)或ΔnleA菌株(空心圆和三角)的小鼠在感染后10天被处 死。分离出结肠(方块)和脾脏(三角形)并称重。实验中的每一只小鼠由一 个点代表。在图中每一组的平均值由水平的横杠表示。
图16A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：61和73)的NleG同源物 的核苷酸和氨基酸序列。
图17A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：62和74)的NleH1的核 苷酸和氨基酸序列。
图18A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：63和75)的NleH2的核 苷酸和氨基酸序列。
图19A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：64和76)的Z2076的核 苷酸和氨基酸序列。
图20A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：65和77)的Z2149的核 苷酸和氨基酸序列。
图21A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：66和78)的Z2150的核 苷酸和氨基酸序列。
图22A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：67和79)的Z2151的核 苷酸和氨基酸序列。
图23A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：68和80)的Z2337的核 苷酸和氨基酸序列。
图24A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：69和81)的Z2338的核 苷酸和氨基酸序列。
图25A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：70和82)的Z2339的核 苷酸和氨基酸序列。
图26A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：71和83)的Z2560的核 苷酸和氨基酸序列。
图27A-B所示为来自EHEC(SEQ ID NOs：72和84)的Z2976的核 苷酸和氨基酸序列。
发明详述
采用可用来显著提高分泌的阳性LEE调节剂(LEE活化物的全能调节 剂(Global Regulator)，或GrlA)，我们鉴定了几种针对A/E病原体的新的 常见分泌蛋白(表2)，并使得我们可采用基于蛋白组学的方法对通过所述 LEE编码的TTSS分泌的蛋白进行功能性的筛选。这些新的蛋白，称为 Nle(非LEE编码的效应物)A-H，存在于含有LEE的病原体中，而并不存 在于非致病性的E.coli菌株和非LEE的病原体中，其是由存在于A/E病 原体中的3PAI在LEE外部编码的，并与所述LEE公进化(3，8)。对这些 蛋白的鉴定，在一些情况下，使得赋予了之前功能未知的ORF的功能。 示例性的蛋白，NleA(p54)，是包括C.rodentium，EPEC和EHEC的A/E 病原体中的III型效应物，并在行使毒力中具有重要作用。与LEE不同， NleA是在所述EHEC基因组内在噬菌体相关致病岛中编码的。所述LEE 编码的TTSS指导了将NleA易位入宿主细胞中，在那里其定位于高尔基 体上。nleA存在于含有LEE的病原体中，而不存在于非致病性的E.coli 菌株和非LEE的病原体中。
在本发明的一些实施方案中，这些多肽和编码这些多肽或其部分的 核酸分子可用作针对A/E病原性感染的有效疫苗、治疗方法、诊断学 或药物筛选工具，或用作反应试剂。
多肽和检测化合物
本发明所述的化合物包括但不限于，此述的多肽和核酸分子，例如 SEQ ID NO：1-56、59-84，及其片段、类似物或变异体。本发明所述的化 合物还包括orf11/grlA、nleA、nleB、nleB2、nleC、nleD、nleE、nleF、 nleG、nleH(nleH1和/或nleH2)基因或其同源物的产物。本发明所述的 化合物还包括此述的多肽和核酸序列，例如，如编号Z0985(NleB2)、 Z0986(NleC)、Z0990(NleD)、Z6020(NleF)、Z6024(NleA)、Z4328(NleB)、 Z4329(NleE)、Z6025(NleG类似物)、Z6021(NleH1)、Z0989(NleH2)、Z2076、 Z2149、Z2150、Z2151、Z2337、Z2338、Z2339、Z2560、Z2976或 L0043(Orf11/GrlA)(登录号AF071034)的所述的EHEC基因组序列(例如 AE005174)及其片段、类似物和变异体。
可通过例如在此述多肽的任意位置上，用其他保守的氨基酸残基， 即具有相似的物理、生物学或化学性质的残基来替换，缺失或插入，并 筛选例如对弱化毒力有用的化合物。在本发明的一些实施方案中，本发 明的所述化合物包括特异性结合本发明所述多肽，例如，SEQ ID NO：22-43、59或73-84的抗体。
在本领域中，众所周知可以在多肽的结构中进行某些修饰和改变而 基本上不改变该多肽的生物学功能，从而得到生物学等同的多肽。在本 发明的一个方面，本发明的多肽也可以扩展为生物学等同的多肽，或通 过保守性氨基酸替换区别于本发明的所述多肽序列的部分序列，或通过 不影响生物学功能，例如毒力的非保守性替换得以区别的“变异体”。正 如本发明所使用的，术语“保守的氨基酸替换”是指在所述多肽的给定 位置上一种氨基酸对另一种氨基酸的替换，其中可以在基本上不丧失相 关功能的条件下进行所述替换。在进行这样的变化时，可以在侧链取代 相对相似性，例如，其大小，电荷，疏水性，亲水性等等的基础上进行 类似的氨基酸残基替换，并且可通过常规的测定分析这些替换对其功能 的作用。
在此使用的术语“氨基酸”是指那些在天然发生的蛋白中发现的L- 氨基酸，D-氨基酸以及被修饰的这些氨基酸。因此，本发明的氨基酸可 包括，例如：2-氨基脂肪酸；3-氨基脂肪酸；β-丙氨酸；β-氨基丙酸；2- 氨基丁酸；4-氨基丁酸；哌啶酸；6-氨基己酸；2-氨基庚酸；2-氨基异丁 酸；3-氨基异丁酸；2-氨基庚二酸；2，4-二氨基丁酸；锁链素；2，2’-二氨 基庚二酸；2，3-二氨基丙酸；N-乙基甘氨酸；N-乙基天冬酰胺；羟基赖氨 酸；别-羟基赖氨酸；3-羟脯氨酸；4-羟脯氨酸；异锁链素；别-异亮氨酸； N-甲基甘氨酸；肌氨酸；N-甲基异亮氨酸；6-N-甲基赖氨酸；N-甲基缬 氨酸；戊氨酸；正亮氨酸和鸟氨酸。
在一些实施方案中，当氨基酸残基被替换成具有类似亲水值(例如， 在±2.0值的范围内，或±2.0，或±1.0，或±0.5)的其他氨基酸时，其中水 疗系数为约-1.6的氨基酸，例如Tyr(-1.3)或Pro(-1.6)的下列氨基酸被指定 为氨基酸残基(如美国专利第4,554,101号详细公开的内容，在此将其引入 作为参考)，如：Arg(+3.0)；Lys(+3.0)；Asp(+3.0)；Glu(+3.0)；Ser(+0.3)； Asn(+0.2)；Gln(+0.2)；Gly(0)；Pro(-0.5)；Thr(-0.4)；Ala(-0.5)；His(-0.5)； Cys(-1.0)；Met(-1.3)；Val(-1.5)；Leu(-1.8)；Ile(-1.8)；Tyr(-2.3)；Phe(-2.5)； 及Trp(-3.4)，可进行保守的氨基酸替换。
在其他实施方案中，当氨基酸残基被替换成具有类似水疗系数(例如， 在±2.0值的范围内，或±2.0，或±1.0，或±0.5)的其他氨基酸时，可进行 保守的氨基酸替换。在这样的实施方案中，在其疏水性和电荷特征的基 础上可对每一种氨基酸残基指定水疗系数，如下：Ile(+4.5)；Val(+4.2)； Leu(+3.8)；Phe(+2.8)；Cys(+2.5)；Met(+1.9)；Ala(+1.8)；Gly(-0.4)； Thr(-0.7)；Ser(-0.8)；Trp(-0.9)；Tyr(-1.3)；Pro(-1.6)；His(-3.2)；Glu(-3.5)； (-3.5)；Asp(-3.5)；Asn(-3.5)；Lys(-3.9)和Arg(-4.5)。
在其他实施方案中，可使用公共可获得的相似性矩阵(60，70，102， 103，94，104，86)进行保守性氨基酸替换。PAM矩阵是基于来源于进化 模型的计数，而Blosum矩阵采用的是来自比对之内高度保守模块的计数。 在PAM或Blosum矩阵中大于零的类似分数可以用来制备保守性的氨基 酸替换。
在其他实施方案中，当用所述相同族中的其他氨基酸替换氨基酸， 可进行保守性氨基酸替换，其中所述氨基酸被分成非极性，酸性，碱性 和中性的族，如下：非极性的：Ala，Val，Leu，Ile，Phe，Trp，Pro， Met；酸性的：Asp，Glu；碱性的：Lys，Arg，His；中性的：Gly，Ser， Thr，Cys，Asn，Gln，Tyr。
保守性的氨基酸改变包括用对应的D-氨基酸、用保守性的D-氨基酸、 或用自然发生的、非遗传编码形式的氨基酸替换L-氨基酸，以及L-氨基 酸的保守性替换。自然发生非遗传编码的氨基酸包括β-丙氨酸，3-氨基 丙酸，2，3-二氨基丙酸，α-氨基异丁酸，4-氨基丁酸，N-甲基甘氨酸(肌氨 酸)，羟基脯氨酸，鸟氨酸，瓜氨酸，t-丁基丙氨酸，t-丁基甘氨酸，N- 甲基异亮氨酸，苯基甘氨酸，环己基丙氨酸，正亮氨酸，戊氨酸，2-萘基 丙氨酸，吡啶基丙氨酸，3-苯并噻吩基丙氨酸，4-氯苯基丙氨酸，2-氟苯 基丙氨酸，3-氟苯基丙氨酸，4-氟苯基丙氨酸，青霉胺，1，2，3，4-四氢-异 喹啉-3-羧酸，β-2-噻吩基丙氨酸，甲硫氨酸亚砜，高精氨酸，N-乙酰赖 氨酸，2-氨基丁酸，2-氨基丁酸，2，4-二氨基丁酸，p-氨基苯丙氨酸，N- 甲基缬氨酸，高半胱氨酸，高丝氨酸，磺基丙氨酸，ε-氨基己酸，δ- 氨基戊酸或2，3-二氨基丁酸。
在其他实施方案中，保守性氨基酸改变包括基于亲水性或疏水性， 大小或体积，或电荷的考虑的改变。主要根据所述氨基酸侧链的性质， 一般而言可将氨基酸分为疏水性的或亲水性的。基于标准化的Eisenberg 等人的一致性疏水等级(71)，疏水性氨基酸表现出的疏水性大于零，而亲 水性氨基酸表现出的亲水性小于零。遗传编码的疏水性氨基酸包括Gly， Ala，Phe，Val，Leu，Ile，Pro，Met和Trp，而遗传编码的亲水性氨基酸 包括Thr，His，Glu，Gln，Asp，Arg，Ser和Lys。非遗传编码的疏水性 氨基酸包括t-丁基丙氨酸，而非遗传编码的亲水性氨基酸包括瓜氨酸和高 半胱氨酸。
根据其侧链的特征，可将疏水性或亲水性氨基酸进一步分组。例如， 芳香族氨基酸是具有侧链的疏水性氨基酸，该侧链含有至少一个芳环或 杂芳环，其含有一种或多种诸如-OH，-SH，-CN，-F，-Cl，-Br，-I，-NO2， -NO，-NH2，-NHR，-NRR，-C(O)R，-C(O)OH，-C(O)OR，-C(O)NH2， -C(O)NHR，-C(O)NRR等等的取代基，其中R是独立的(C1-C6)烷基，取 代的(C1-C6)烷基，(C1-C6)烯基，取代的(C1-C6)烯基，(C1-C6)炔基，取代 的(C1-C6)炔基，(C5-C20)芳基，取代的(C5-C20)芳基，(C6-C26)烷芳基，取代 的(C6-C26)烷芳基，5-20元杂芳基，取代的5-20元杂芳基，6-26元烷基杂 芳基或取代的6-26元烷基杂芳基。遗传编码的芳香族氨基酸包括Phe， Tyr和Trp，而非遗传编码的芳香族氨基酸包括苯丙氨酸，2-萘基丙氨酸， β-2-噻吩基丙氨酸，1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸，2-氟苯 丙氨酸，3-氟苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。
非极性氨基酸是在生理pH时侧链没有电荷的疏水性氨基酸，且在其 所成的键中，两个原子共用的电子对于每个原子的距离相同(即所述侧链 没有极性)。遗传编码的非极性氨基酸包括Gly，Leu，Val，Ile，Ala和 Met，而非遗传编码的非极性氨基酸包括环己基丙氨酸。非极性氨基酸还 可被进一步分成脂肪族氨基酸，其是含有脂肪族烃侧链的疏水性氨基酸。 遗传编码的脂肪族氨基酸包括Ala，Leu，Val和Ile，而非遗传编码的脂 肪族氨基酸包括正亮氨酸。
极性氨基酸是在生理pH时侧链没有电荷的亲水性氨基酸，但在其所 成的键中，两个原子共用的电子对离其中的一个原子更近。遗传编码的 极性氨基酸包括Ser，Thr，Asn和Gln，而非遗传编码的极性氨基酸包括 N-乙酰赖氨酸和甲硫氨酸亚砜。
酸性氨基酸是侧链pKa值低于7的亲水性氨基酸。酸性氨基酸通常 由于丢失一个氢离子在生理pH时具有负电荷的侧链。遗传编码的酸性氨 基酸包括Asp和Glu。碱性氨基酸是侧链pKa值大于7的疏水性氨基酸。 碱性氨基酸通常由于与水和氢离子相连在生理pH时具有正电荷的侧链。 遗传编码的碱性氨基酸包括Arg，Lys和His，而非遗传编码的碱性氨基 酸包括鸟氨酸，2，3-二氨基丙酸，2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。
本领域所属技术人员应当理解，以上分类并不是绝对的，而且可以 多种方式对氨基酸进行分类。此外，可基于公知的状态和或特征性的化 学、物理，或基于特异性分析的生物学性质，或与之前已鉴定氨基酸的 比较来对氨基酸进行分类。氨基酸还可包括具有类似于氨基酸侧链的双 官能部分。
保守性改变还可包括通过例如氨基酸的官能侧链反应，对非衍生残 基进行化学衍生部分的取代。因此，这些取代基可包括这样的化合物， 其游离的氨基被衍生成盐酸胺，p-甲苯磺酰基，卞氧羰基，t-丁氧羰基， 氯乙酰基或甲酰基。类似地，游离的羧基可被衍生形成盐，甲基或乙基 酯或其他类型的酯或肼，且侧链可被衍生形成游离羟基的O-酰基或O- 烷基衍生物，或组氨酸咪唑氮的N-亚氨苯甲基组氨酸。多肽类似物还可 包括被化学改变的，例如甲基化，通过诸如乙胺，乙醇胺或乙二胺的烷 基胺对C-末端氨基酸的酰胺化，或对氨基酸侧链的乙酰化或甲基化(例如 对赖氨酸ε氨基的乙酰化)的氨基酸。多肽类似物还可包括用取代的酰胺 (例如，通式为-C(O)-NR的基团，其中R是(C1-C6)烷基，(C1-C6)烯基，(C1-C6) 炔基，取代的(C1-C6)烷基，取代的(C1-C6)烯基或取代的(C1-C6)炔基)对酰 胺键进行替换或酰胺键的同电子排列体(例如，-CH2NH-，-CH2S， -CH2CH2-，-CH＝CH-(顺式和反式)，-C(O)CH2-，-CH(OH)CH2-或-CH2SO-)。
所述化合物可以是共价连接的，例如通过聚合或轭合形成共聚物或 杂聚物。间隔物和连接物通常由小型的中性分子构成，例如可使用在生 理条件下不带电荷的氨基酸。可采用多种方法完成连接。例如可在所述 多肽末端加上半胱氨酸残基，通过控制的氧化将若干多肽共价连接。或 者，可采用异双官能团试剂，例如二硫化物/酰胺形成试剂或硫醚/酰胺形 成试剂。所述化合物还可被连接于另一个化合物，该化合物具有例如， 调节免疫原性反应的功能。可通过例如具有环部分对所述化合物进行限 制。
可通过标准化学方法，例如通过使用液相或固相合成方法自动合成 多肽或多肽类似物。自动化多肽合成仪是可商业获得的，其采用的是本 领域公知的技术。还可以使用重组DNA技术，使用诸如在Sambrook等 人(110)或Ausubel等人(111)的描述中的标准方法制备多肽和多肽类似物。 一般而言，可根据本领域公知的方法，从天然产物或合成(半合成)提取物 或化学文库的大文库中对候选化合物进行鉴定。在药物发现和开发领域 所属的技术人员应该理解，检测提取物或检测化合物的准确来源并不是 本发明方法的关键问题。因此，采用本发明所述的示例性方法，可以筛 选到任意数量的化学提取物或化合物。这些提取物或化合物的例子包括， 但不限于，基于植物、真菌、原核生物或动物的提取物，发酵培养液和 合成化合物，以及对业已存在化合物的修饰。还有多种方法可用来产生 任意数量化合物，包括但不限于，基于多糖、脂、多肽和核酸的化合物 的随机性或指导性(例如半合成或全合成)合成。合成化合物文库是可商业 获得的。另外，以细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文 库也可从多种来源获得，包括Biotics(苏塞克斯，英国)，Xenova(斯劳， 英国)，Harbor Branch海洋学研究所(Ft.Pierce，佛罗里达州，美国)和 ParmaMar，马萨诸塞州，美国。此外，如果需要的话，根据本领域公知 的方法，例如，通过标准提取和分离方法，可生产例如A/E病原体多肽 的天然和合成文库。而且，如果需要的话，可使用标准的化学，物理或 生物化学方法轻而易举地对任何文库或化合物进行修饰。
当发现某种粗提取物能够调控毒力时，有必要对所述阳性前导提取 物进行分离，从而提取出导致所观察效果的化合组分。因此，提取、分 离和纯化方法的目的在于在含有毒力调节性质的所述粗提取物范围内对 其化学实体进行仔细地表征和鉴定。用于对混合物中化合物的活性进行 测定的，与在此描述相同分析方法也可用来纯化所述活性组分和测定其 衍生物。对这些异源提取物进行分离和纯化的方法是本领域所公知的。 如果需要的话，可根据本领域公知的方法对表现出作为治疗有效制剂的 化合物进行化学修饰。随后可采用针对A/E致病性感染的Citrobater或牛 模型，或针对A/E致病性感染的任意其他动物模型对鉴定为具有治疗性、 预防性、诊断性或其他价值的化合物进行分析。
疫苗
“疫苗”是含有能够引起所希望的免疫反应的物质的组合物。疫苗 可以选择、活化或扩展免疫系统的记忆性的B和T细胞，使其能够例如， 清除感染性制剂，例如A/E病原体或其成分。在一些实施方案中，疫苗 包括适合的载体，例如佐剂，其是以非特异性方法作用来提高针对特异 性抗原或一组抗原的免疫反应的制剂，能够在需要产生预期免疫反应的 任意给定的疫苗剂量中降低抗原的量或能够降低剂量的频率。所需要的 免疫反应包括全部或部分的针对由A/E病原体引起的扩散(存在于已感染 动物，例如哺乳动物的粪便)或集群(存在于已感染动物，例如哺乳动物的 肠道)的防护。例如，当与非免疫动物相比较时，所希望的免疫反应可包 括在免疫动物中10-100％间，例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、 70％、80％、90％、100％针对由A/E病原体引起的扩散或集群的防护。
如本发明所述的疫苗可包括此述的多肽和核酸分子，或其免疫原性 片段，并可采用本领域公知或此述的任意给药形式进行给药。在本发明 的一些实施方案中，所述疫苗包括活的A/E病原体，灭活的A/E病原体， 或其组分。活的A/E病原体，其可以口服疫苗的形式给药，其可含有能 够影响所述A/E病原体毒力，但不因性免疫反应诱导的不可恢复的遗传 改变。活疫苗能够在所接种的动物，例如哺乳动物中的肠中集群。
在一些实施方案中，可将此述的多肽和核酸分子，或其免疫原性的 片段或此述突变的细菌(例如，弱化的细菌)给药家禽，例如，鸡、鸭、火 鸡等等，从而在所述家禽中引起免疫反应，例如产生抗体。从这些家禽 获得的蛋或其制品，表现出了针对此述多肽和核酸分子或其免疫原性的 片段产生免疫反应，可将其给药于动物，例如，人、牛、山羊、绵羊等 等从而在所述动物中引起针对此述多肽和核酸分子或其免疫原性片段的 免疫反应。在家禽中产生抗体和给药这些抗体的方法在Cook，申请日为 1998年5月12日的美国专利第5,750,113号；Ivarie等人，申请日为2004 年5月4日美国专利第6,730,822号和本文的参考文献113-117中有详细 描述。
可以通过本领域公知的技术，通过添加重组或纯化的抗原，例如 EspA、EspB、EspD、EspP、Tir、志贺氏毒素1或2、和/或紧密粘附 素对本发明的疫苗进行进一步补充。例如，已有关于重组子制备和诸 如EspA、Tir、EspB和紧密粘附素的EHEC O157:H7蛋白的使用的 报道(PCT申请公开WO 97/40063；PCT申请公开WO 99/24576；51)
细胞培养
可根据本领域公知的任意方法或此述的方法进行A/E病原体的培养。 例如，可首先将行A/E病原体培养于Luria-Bertani(LB)培养基中约8-48 小时，或约12-24小时，然后以约1∶5-1∶100，例如1∶67、或约1∶5-1∶25、 或约1∶10，稀释入M-9基本培养基中，其中添加了20-100mM NaHCO2或NaHCO3，或约30-50mM，或约44mM NaHCO2或NaHCO3；4-20mM MgSO4，或约5-10mM；或约0.8mM-8mM MgSO4，0.1-5％葡萄糖，或 约0.2-1％，或约0.4％葡萄糖和0.05-0.5％酪蛋白氨基酸，或约0.07- 0.2％，或约0.1％酪蛋白氨基酸。培养一般保持在约37℃，任意的2-10％ CO2，或任意的约5％CO2，且生长至在600nm的光密度为0.7-0.8。采用 任意适当的方法，例如微过滤或离心去除全部细胞，并使用透析，超滤 等等方法将所述上清液浓缩，例如10-1000倍或更高，例如100。采用本 领域公知的方法可容易地测定总蛋白。
可使用在此所述或本领域公知的，包括野生型或突变A/E病原体的 任意A/E病原体，例如EHEC的培养物，生产细胞培养上清液。一般而 言，所述A/E病原体是在适于III性抗原分泌条件下，在适当的培养基中 进行培养的(美国专利第6,136,554号和第6,165,743号)(51，74)。
其他基因的分离和鉴定
根据此述的核苷酸和氨基酸序列，例如，SEQ ID NO：1-56或59-84， 可以使用标准方法对其他基因进行分离和鉴定。任意的A/E病原体都可 作为这些基因的来源。
在一些实施方案中，可使用此述的核酸序列来设计探针或引物，包 括根据该序列的任意一条DNA链简并的寡核苷酸探针或引物。然后可使 用标准的扩增或杂交技术，使用所述探针或引物对基因组或cDNA文库 进行筛选获得来自其他A/E病原体的基因。
在一些实施方案中，可使用此述的氨基酸序列产生抗体或其他制剂， 其可用于从与这些抗体结合的A/E病原体中筛选多肽。
在一些实施方案中，可通过用抗原决定簇序列(例如，FLAG或2HA) 标记本发明的(例如，那些与SEQ ID NO：22-43、59或73-84基本上相同 的)多肽，并通过用含有编码本发明多肽的核酸序列的适当载体进行转染， 或通过内源性细菌III型传递，将其导入宿主细胞，然后通过对所结合伴 侣进行免疫沉淀和鉴定，对所述结合伴侣进行鉴定。可以用表达FLAG 或2HA融合蛋白的菌株感染HeLa细胞，然后裂解，并用抗FLAG或抗 2HA抗体进行免疫沉淀。可通过质谱对结合伴侣进行鉴定。如果不能产 生足量的本发明所述多肽，这样的方法就不能传递足量的标记蛋白从而 鉴定其伴侣。作为互补方法的一部分，可将本发明的每种多肽克隆至融 合于例如2HA、GFP和/或FLAG的哺乳动物转染载体中。转染之后，可 将HeLa细胞裂解并将所述标记的多肽免疫沉淀。可通过SDS PAGE然后 进行质谱对所述结合伴侣进行鉴定。
在一些实施方案中，可对本发明的多肽进行标记，过量产生，并用 于亲和柱，从而鉴定和/或确认所鉴定的靶化合物。FLAG，HA和/或His 标记的蛋白可被用于这些亲和柱，从而从细胞提取物中提取宿主细胞因 子，并可通过标准结合分析，饱和曲线和其它此述或本领域公知的方法 对任意采样进行确证。
在一些实施方案中，可采用细菌双杂交系统来研究蛋白-蛋白互作。 可将此述的核酸序列或与其基本上相同的序列克隆至所述双杂交系统的 pBT饵质粒，并将商业可获得的5×106独立克隆的鼠脾文库用作所述饵的 靶文库。可通过回收所述质粒进一步表征潜在的命中目标，并再次转化 以降低来自克隆饵变异体和文库靶克隆的假阳性，所述克隆饵变异体和 文库靶克隆能激活独立于所述克隆饵的报道基因。如本文所述，可采用 此述的方法对可再生的命中目标进行深入研究。
在一些实施方案中，将表达GrlA的A/E病原体菌株，例如，表达克 隆的GrlA的EHEC O157菌株用于A/E III型分泌蛋白质组的蛋白组学分 析，例如可使用对上清液的2D凝胶分析。此外，可将全部的A/E病原体 (例如EHEC阵列)用来确定哪些基因是由GrlA调节的。可采用此述或本 领域公知的方法对毒力进行分析。
一旦鉴定了编码序列，就可以使用标准的克隆方法将其分离出来， 并插入了任意适合的载体或复制子中，进行例如，多肽的生产。这样的 载体和复制子包括但不限于，噬菌体X(E.coli)、pBR322(E.coli)、 pACYC177(E.coli)、pKT230(革兰氏阴性菌)、pGV1 106(革兰氏阴性菌)、 pLAFR1(革兰氏阴性菌)、pME290(非E.coli革兰氏阴性菌)、pHV14(E.coli 和枯草芽孢杆菌)、pBD9(芽孢杆菌)、pIJ61(链霉菌)、pUC6(链霉菌)、 Yip5(酵母)、YCp19(酵母)或牛乳头瘤病毒(哺乳动物细胞)。
一般地，可在用适当载体转化或转染的任意适合的宿主细胞中生产 本发明的所述多肽(69)。转化或转染的方法以及表达载体的选择都依赖于 所选定的宿主系统。可采用多种表达系统，所采用的精确的宿主细胞对 本发明并不重要。例如，可在原核宿主(例如，E.coli)或真核宿主(例如， 啤酒酵母，昆虫细胞，例如，Sf21细胞，或哺乳动物细胞，例如，NIH3T3， HeLa或COS细胞)中生产本发明所述的多肽。这样的细胞可来自多种途 径(例如，美国典型培养物保藏中心，Manassus，美国)。适合多肽生产 的细菌表达系统包括E.coli pET表达系统(Novagen，Inc.，麦迪逊，维斯康 星州)，以及pGEX表达系统(Pharmacia)。
分析
可采用此述或本领域公知的多种技术对包括多肽，核酸分子和小分 子的候选化合物进行筛选和测定。能够降低本发明所述任一多肽或核酸 分子的表达水平的化合物可作为有效的、例如A/E致病性感染的治疗剂。
可以通过标准Northern杂交分析，使用基于本发明的任意适合的核 酸片段作为杂交探针，测定基因表达进行筛选分析，其中将存在所述候 选化合物时的基因表达水平与不存在所述候选化合物时的基因表达水平 进行比较。可选择地，或另外地，可以使用例如免疫沉淀或Western杂交 的方法在所述多肽表达或分泌的水平上测定候选化合物的效果。
还可以进行如下的其他分析：
III型分泌的确认以及易位入宿主细胞
为了测定哪一种候选化合物需要TTSS分泌，可将每一种基因或其部 分融合于FLAG在其C末端，并从WT和TTSS突变体，例如，此述或 本领域公知的WT EHEC和同源的escNIII型突变体收集上清液。其他测 定分泌的方法包括测定在所述突变菌株上清液中分泌产物的损失，或对 于所述蛋白所产生的抗体，以及对WT和III型上清液采用Western分析。 为了确定没有任何感兴趣的蛋白是TTSS成分，需要对生长在III型诱导 条件下的每种候选化合物上清液进行III型分泌的测定。LEE TTSS分泌 两组蛋白：集中于细菌细胞表面的易位子(EspA、B和D)，以及被直接易 位入宿主细胞的效应物。可以对候选化合物进行检测从而测定其是效应 物或易位子。例如，在EHEC中FLAG标记的推测的效应物或其他A/E 病原体可被用来感染培养的HeLa上皮细胞，或在用抗-FLAG抗体染色 之后通过免疫荧光显微镜进行测定。这样的可视效果通常都能证明细菌 传递到了所述宿主细胞，并通常说明哪一个细胞器是所述效应物的靶位 (例如，Tir到膜，NleA到高尔基体)。针对多种细胞分隔的抗体可被用来 确认所述定位。为了与所述可视效果互补，可使用公知的分离方法(30) 将感染的HeLa细胞分成细胞溶质，不可溶和膜组分，并使用抗-FLAG 抗体进行Western分析从而测定所述效应物靶相于那种细胞组分。作为对 照，可使用在TTSS缺陷性菌株中表达的具有标记的效应物感染细胞。如 果靶向于所述膜组分，则可使用高盐或碱性pH处理来测定是否其是完全 的膜蛋白。如果所述候选化合物以低水平表达，那么通过免疫荧光测定 易位是相当困难的，而对于腺苷酸环化酶可进行遗传融合，该酶需要哺 乳动物细胞质辅因子(钙调蛋白)得以具有活性(87)。
支架形成和摄取的效果
假设肌动蛋白凝聚和基架形成是A/E病原体的主要标志，那么可以 在例如培养的HeLa上皮细胞中针对蛋白凝聚和基架形成来筛选候选化 合物。
EPEC和EHEC侵入是另一种容易测定的细胞培养表现型，且可给出 培养的上皮细胞的互作和改变宿主细胞骨架的指示(III型突变体不侵入， 缺乏Tir和紧密粘附素的菌株也不侵入)。可以使用庆大霉素保护分析， 在wt和III型突变体A/E病原体之中，例如在HeLa细胞中的WT和TTSS 突变体EHEC中，对各种候选化合物的侵入水平进行比较。
此外，正如EPEC和EHEC在培养的巨噬细胞中通过以III型依赖性 的方式抑制宿主PI-3激酶活性来抑制巨噬作用，可以测定所述候选化合 物对所培养的巨噬细胞的吞噬作用的阻断的能力(Celli，J.，M.Olivier 和B.B.Finlay.2001通过对PI-3激酶依赖性途径的抑制肠出血性大肠杆 菌对抗吞噬作用的介导。Embo J 20：1245-58)。如果没有任何一种候选 化合物能够抑制吞噬作用，则进行PI-3激酶抑制的后续分析。
对极化上皮单层细胞的作用
连接完整性在腹泻中具有重要的作用。除了基架形成，A/E病原体还 能引起其他对于极化上皮细胞的LEE III型作用，包括微绒毛(微绒毛效 应)的丧失和跨单层电阻、紧密连接尺寸的丧失。使用极化的人肠单层 Caco-2细胞，可将高分辨率的扫描电子显微镜应用于感染了WT A/E病 原体(例如，WT EHEC)，TTSS突变体A/E病原体，例如EHEC escN，以 及每种所述候选化合物。可利用标准技术对单层细胞进行多次感染、洗 涤和处理用于SEM(66)，并在感染了极化的Caco-2细胞之后，筛查电阻 的损失。
对先天免疫和炎症的影响
在病原体中快速出现的主题是抑制先天免疫和炎症反应的能力。已 经对诸如EHEC和EPEC的A/E病原体的这些影响进行了报道，且这些 分析可被用来检测在WT和TTSS突变体A/E病原体菌株中的候选化合 物。例如，EHEC引起了对NF-κβ的抑制，导致了诸如HeLa细胞中的Il-8、 Il-6和Il-1α几种细胞因子的抑制(80)，该方法需要LEE TTSS。可以在， 例如HeLa细胞感染之后，使用诸如RT-PCR(实时PCR)，也商业可获得 的ELISA分析的标准方法，对候选化合物对这些因子的抑制进行分析。
基于定位信息的功能性研究
除了表型分析，根据其对宿主细胞的定位也可对候选化合物进行分 析。例如，如果某种候选化合物定位于高尔基体，则可对其进行分析从 而测定是否其会影响高尔基体的功能，包括在表达所述候选化合物的酵 母中进行生化研究测定糖基化和功能性高尔基体分析。如果所述候选化 合物定位于线粒体，则可进行对调亡和其他线粒体功能的分析。如果所 述候选化合物靶定于内质网，则可设计蛋白合成和分泌的分析。如果发 生了细胞核的靶向，则可实施转录研究。
毒力的作用
竞争性指数(CI)可用来广泛地测定小型毒力因子的作用，以及是否两 种毒力因子归属于相同的毒力“途径”(63)。简言之，可将两种具有不同 抗生素抗性标记的菌株共感染动物，在适当的孵育时间之后，将所述细 菌收获并测定两种菌株的比例。数值为1说明毒力相等。如果鉴定的化 合物对毒力有影响，则可测定其与WT相比的CI。CI也可用来测定所述 候选化合物归属与哪条毒力途径。例如，除了将每一种毒力因子的突变 体与WT进行比较，还可以通过对这两种毒力因子的突变体进行比较测 定CI。当对一种突变体以及双突变体进行比较时，CI值为1说明他们归 属于相同的一般性毒力途径，而任意其他不是1的情况都说明它们处于 不同的毒力“途径”。
显微镜研究
可使用包括透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)的显微 镜技术来对A/E病原体疾病进行表征，从而对来自REPEC感染兔子远端 回肠派伊尔(氏)淋巴集结中的淋巴滤泡(小结)进行测定，进而确认A/E 损伤的形成(63)，使用共聚焦显微技术来表明进入感染小鼠的鼠绒毛的传 递和所述疾病过程的组织学分析。
这些技术可用来在适当的动物模型分析候选化合物，例如，用携带 有所述候选序列上有突变的各种Citrobacter菌株感染的小鼠。对每一种 候选化合物而言，都可在(或缺乏)该系统中，在所述疾病发展之后进行综 合研究。此外，还可以测定这些突变体在肠表面的集群水平。可以在对 肠组织进行收获之后，用抗生素标记的菌株感染动物。可将组织匀浆， 并通过平板计数在选择性平板上定量所述细菌。
A/E病原体致病性感染，例如，Citrobacter感染的主要特征是广泛性 的炎症。可以进行共聚焦显微分析来跟踪在候选化合物中各种突变体的 炎症细胞事件。通过用抗体或凝集素对组织进行标记，然后采用共聚焦 显微技术，与父系菌株相比，可对由所述突变体导致的聚集于感染位点 的炎症细胞进行定义。对应于若干先天反应因子的抗体是可获得的并用 来对感染过程中的突变体表型进行分析，测定先天反应因子以及诸如巨 噬细胞，中性粒细胞，iNOS产生细胞，树突状细胞等等的细胞。
组织学研究
可以对染色的组织进行组织学研究。例如，可对用REPEC和在候选 化合物中有缺失的菌株感染的兔的苏木精和曙红染色的回肠切片进行研 究，从而对炎症和组织损伤进行比较，并对A/E病原体感染进行表征(58)。 还可以用缺乏候选化合物的Citrobacter菌株在小鼠中进行类似的染色。 可以进一步定义与Citrobacter及其同源突变体相关炎症的几种其它组织 学染色也是可获得的，包括吉姆萨(Giemsa)和甲苯胺蓝(Toluidine Blue O)(适用于普通形态学)，过碘酸-希夫氏染色反应(Periodic Acid-Schiff)(对 糖进行染色，允许对肠粘液层和杯状细胞进行检测)，革兰氏染色，氯醋 酸酯酶(炎症细胞染色)和半胱天冬酶(caspase)分析(适用于调亡)。免疫组 织化学允许旨在针对细菌和哺乳细胞抗原的抗体的应用。
抗体
使用标准技术制备方法(45)或本领域公知的方法，可将本发明的化合 物用来制备针对本发明多肽的抗体。
例如，可将本发明多肽的编码序列纯化至免疫兔子的必须程度。为 了降低抗血清的低亲和性或特异性的潜在问题，可对每种蛋白生成2或3 种多肽构建体，并将每种构建体注射到至少2只兔子中。可通过一系列， 优选为包括至少三次加强注射的注射来产生抗血清。可采用弗氏完全佐 剂进行初次免疫，然后采用弗氏不完全佐剂进行后续免疫。可采用Western 杂交和使用所述纯化蛋白的免疫沉淀分析对抗体滴度进行监测。可使用 CNBr-葡聚糖偶联蛋白对免疫血清进行亲和纯化。可使用不相关的蛋白板 测定抗血清的特异性。可选择地，或除此之外，可以产生对应于本发明 多肽相对唯一的免疫原性区域的多肽，并通过引入的C-末端赖氨酸与钥 孔戚血蓝素(KLH)偶联。对这些多肽中每一种的抗血清都可通过轭合于 BSA的多肽进行亲和纯化，使用多肽轭合物在ELISA和Western杂交并 通过Western杂交和免疫沉淀测定特异性。
可选择地，可根据标准杂交瘤方法制备与本发明任一多肽特异性结 合的单克隆抗体(91，90，89，78)。一旦产生出来，可通过Western杂交 或免疫沉淀对单克隆抗体的特异性识别进行测定。可认为那些与本发明 所述多肽特异性结合的抗体是有用的；这样的抗体可用作，例如，免疫 分析。也可以使用上述的本发明所述多肽和噬菌体显示文库制备其他的 单克隆抗体(112)。
在一些实施方案中，可使用表现为具有免疫原性的多肽片段，制备 抗体，该免疫原性是通过诸如具有较高频率的带电荷的残基作为标准。 例如，通过使用含有来自于一个种类的抗原结合区域和来自其他种类Fc 部分的嵌合抗体，或通过使用来自适合类型杂交瘤制备的抗体，可对抗 体进行定制来降低不利的宿主免疫反应。
在一些实施方案中，可使用针对此述任一多肽的抗体来治疗或预防 由A/E病原体引起的感染。
动物模型
可在多种A/E病原体感染的动物模型中对化合物进行快速的筛选。
Citrobacter鼠感染模型是天然发生的疾病模型，而成年牛EHEC扩散 模型则是天然非疾病携带模型(牛并未生病，而EHEC也不是正常菌群的 一部分)。对Citrobacter模型而言，可根据以上描述对小鼠中的毒力突变 体进行筛选。可使用敲除(KO)/突变体小鼠来研究感染中候选序列的作 用。已经开发了几种包括定义iNOS(20)、T和B细胞(106)、Tlr-4的功能 并建立了一些列具有宿主易感性(54)以及Nck的KO小鼠品系。
对于牛的模型，可在一岁内的牛中筛选EHEC突变体(参见，例如， PCT申请国际公开第WO 02/053181号)。简言之，通过口-胃插管法，可 将108CFU的突变体或WT O157传递入牛体内。接种后14天，可通过 选择性涂板监测粪便扩散，通过多重PCR，扩散水平，以及在EHEC集 中的肛门区域的组织学和显微镜分析证明聚集情况(97)。其他的模型还有 牛肠环模型，其中向肠环注射EHEC，并在各个时间进行组织学和显微镜 学检查，并通过涂布定量所吸附的细菌。
可以按下方式制备RDEC-1感染的天然兔感染模型：通过离心收集 过夜细菌培养物，并重悬于1毫升磷酸缓冲盐水中。将新西兰白兔(重量 为1.0-1.6kg)禁食过夜，然后使用口胃管将5毫升2.5％无菌的碳酸钠和1 毫升RDEC-1或候选序列突变菌株(2：-5×1010)接种入胃中。在之后一天以 相同剂量的细菌对每只兔子进行接种。每只兔子每天都称重，通过直肠 擦拭并从粪球中收集细菌的排泄物扩散。将直肠擦拭棉签在含有萘啶酸 的MacConkey平板的表面上旋转半圈。从每只兔子收集5团粪便或相同 数量的液体粪便，将其重悬于3毫升磷酸缓冲盐水中，并将0.1毫升的每 种粪便悬液涂布于含有萘啶酸的MacConkey平板上。将抗萘啶酸克隆的 生长计分如下：0，没有生长；1，较大间隔的克隆；2，间隔较近的克隆； 3，汇合生长的克隆。通过静脉注射氯胺酮或过量给药苯巴比妥钠处死动 物后立即将组织剪切下来。对在肠系统中细菌聚集数量的分析如下：将 肠部分(10厘米)，除了盲肠，在其近段和远端双重结扎，并在所述双重 结扎部分之间切断，然后用10毫升并冷却的磷酸缓冲盐水进行冲洗。向 来自所述盲肠的1克粘性成分中加入9毫升磷酸缓冲盐水。将所得的磷 酸缓冲盐水悬液稀释，并涂布于含有萘啶酸的MacConkey平板上。使用 9mm直径的木塞打孔器对组织样本进行剪切，用磷酸缓冲盐水洗涤三次， 加入2毫升冰预冷的磷酸缓冲盐水，用匀浆器匀浆，然后将系列稀释的 样本涂布于MacConkey平板。可以通过下式计算出每平方厘米上附着的 细菌数：
CFU/cm2＝细菌数/平板×稀释因子×2ml/-0.452。
治疗和诊断
本发明所述的多肽和核酸分子可用作治疗剂，例如，制备疫苗或治 疗组合物、或弱化毒力的A/E病原体构建体。可通过例如在基于本发明 所述核酸序列的基础上设计引物，和使用基于sacB序列的等位基因交换 的在本文中所述的技术，构建这样的A/E病原体构建体(29)。所述多肽和 核酸分子可以单独使用或相互或与其它适合的分子，例如EspA、EspB、 EspD、EspP、Tir、志贺氏毒素1、志贺氏毒素2或紧密粘附素组合使 用。
在一些实施方案中，可将本发明所述的核酸分子用于反义技术中。 参考于核酸在此使用的“反义”一词，是指互补于核酸分子编码链，例 如，诸如nleA、nleB、nleC、nleD、nleE或nleF基因的基因，或互补 于与SEQ ID NO：1-21或60-72或其片段或变异体的任一序列基本上相同 的核酸序列的核酸序列。在一些实施方案中，反义核酸分子是当与其互 补基因都在细胞中表达时，能够降低其互补基因编码多肽水平的核酸分 子。在一些实施方案中，与在仅表达所述基因而不是所述互补反义核酸 分子的细胞中的多肽水平相比，所述多肽水平下降了至少10％-至少25％ 中的任一整数，或至少25％-至少50％中的任一整数，或至少50％-至少 75％中的任一整数，或至少75％-至少100％中的任一整数。
在一些实施方案中，可采用RNA干涉(RNAi)技术，一种转录后基因 沉默类型的技术，对基因或编码或非编码感兴趣区域的表达进行抑制或 阻碍。RNAi可用来创建功能性的“敲除”，即，降低基因或编码或非编 码感兴趣区域的表达能够被诱导的系统，从而得到所述编码产物的总体 水平的降低。因此，可对感兴趣的核酸或其片段或变异体进行RNAi靶 向操作，从而降低其编码产物的表达水平和活性。这样的系统可用来对 所述产物进行功能性研究，并治疗由A/E病原体引起的感染。RNAi在例 如美国专利申请第20020173478号(Gewirtz；公开于2002年11月21号) 和第20020132788号(Lewis等人；公开于2002年11月7号)中已被公开 (79，67)。进行RNAi的试剂和试剂盒是可以从，例如，Ambion Inc(奥斯 定，德克萨斯州，美国)和New England Biolab Inc.(贝弗利，马萨诸塞州， 美国)商业获得的。
在一些系统中，最初的RNAi试剂被认为是对应于靶核酸的dsRNA 分子。随后认为所述dsRNA分子可被切割成21-23核苷酸长度(19-21bp 的双链，每个具有2个核苷酸的3’突出端)的短的干涉RNA(siRNA)。影 响这一最先剪切步骤的酶被称为“剪切酶(Dicer)”，并被分为dsRNA特 异性核酸酶中的III类RNA酶。可选择地，可通过直接导入细胞，或通 过向所述细胞导入这样的siRNA或类siRNA分子的适合前体(例如，载 体，等等)使得RNAi产生作用。siRNA可随后与其他细胞内组分结合从 而形成RNA-诱导的沉默复合体(RISC)。由此形成的所述RISC可随后通 过其siRNA组分和靶转录本之间同源程度的碱基配对互作靶定感兴趣的 转录本，导致从所述siRNA的3’末端对所述靶转录本进行约12个核苷酸 的剪切。因此，所述靶mRNA被剪切，且其编码的蛋白产物的水平也被 降低。
可通过向细胞中引入适合的体外合成的siRNA或类siRNA分子来使 得RNAi起作用。可使用例如化学合成的RNA来进行RNAi(64)，其中可 采用公知的方法化学合成适当的RNA分子。或者，可使用适当的表达载 体在体外或体内转录这些RNA。可使用例如T7 RNA聚合酶对有义和反 义链(由同一载体或分开的载体上的序列编码的)进行体外转录，其中所述 载体可包括可操作的连接于T7启动子的适当编码序列。在所述实施方案 中，体外转录的RNA可被体外处理(例如，使用E.coli III型RNA酶)成 适于进行RNAi的长度。可将有义和反义转录物合并形成导入感兴趣的 靶细胞的RNA双链。也可以使用表达能被处理成类siRNA分子的小发 夹RNA(shRNA)的其他载体。多种基于载体的方法是本领域公知的(65， 93，95，98，99，105，109)。将这些载体通过体外或体内(例如，基因治 疗)引入细胞的多种方法也是本领域公知的。
因此，在某个实施方案中，包括与SEQ ID NO：22-43的任一序列基 本上相同的氨基酸序列的表达，可通过向细胞中引入或在细胞中产生对 应于编码所述多肽或其片段，或对应于其同源核酸的siRNA或类siRNA 分子得到抑制。在多个实施方案中，这样的方法使得需要直接给药，或 使用上述的基于载体的方法将siRNA或类siRNA分子导入细胞。在一个 实施方案中，所述siRNA或类siRNA分子的大小小于约30个核苷酸。 在其他实施方案中，所述siRNA或类siRNA分子的大小约为21-23个核 苷酸。在一个实施方案中，siRNA或类siRNA分子包括19-21bp的双连 部分，每条链还含有2个核苷酸的3’突出端。在实施方案中，所述siRNA 或类siRNA分子基本上与编码所述多肽或其片段或变异体(或变异的片段) 的核酸相同。这样的变异体能够编码具有由SEQ ID NO：22-43编码的多 肽活性的蛋白。在实施方案中，所述siRNA或类siRNA分子的有义链基 本上与SEQ ID NO：1-21或其片段(RNA用U替换了DNA序列上的T)相 同。
在一些实施方案中，所产生的针对本发明所述多肽的抗体可用来治 疗由A/E病原体引起的感染。
在一些实施方案中，本发明所述的多肽和核酸分子可用来测定样本 中A/E病原体的存在。所述核酸分子可用来设计例如，能够与样本中A/E 病原体的DNA杂交，或可用来使用例如聚合酶链反应技术在样本中对 A/E病原体的DNA进行扩增的探针或引物。所述多肽可用来，例如，产 生与由A/E病原体表达的多肽特异性结合的抗体。这样的探针或引物或 抗体可进行可检测的标记。“可检测的标记”是指对分子，例如寡核苷酸 探针或引物，基因或其片段，或cDNA分子的存在进行标记和鉴定的任 意方法。可检测的标记分子的方法在本领域内是公知的，包括但不限于， 放射性标记(例如，使用诸如32P或35S的同位素)和非放射性标记，例如 酶标记(例如，使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶)，化学发光标记，荧光标 记(例如，使用荧光素)，生物发光标记，或对附着于所述探针的配体的抗 体检测。这一定义还包括可通过用间接方法标记的，例如，结合于第一 部分(例如生物素)，其又结合于可进行观察或分析的第二部分(例如荧光 素标记的抗生蛋白链菌素)的可检测的分子。标记还包括地高辛，荧光素 酶和水母素。
制药和兽药组合物，剂量和给药
所述化合物包括此述的多肽和核酸分子以及使用本发明方法鉴定的 化合物。在存在脂质体、佐剂或任一药物可接受载体，以适于对哺乳动 物，例如人、牛、绵羊等等给药的适当形式条件下，可单独提供本发明 所述的化合物或与其他化合物(例如，核酸分子、小分子、多肽、肽或肽 类似物)组合提供。如果需要的话，可用基于本发明的化合物与多种传统 和现存的治疗剂联合治疗A/E病原体感染。
可使用常规的制药方法提供适合的制剂或组合物从而对A/E病原体 感染的患者给药所述化合物。可以采用任意适合的、例如非肠道的、静 脉的、皮下的、肌肉的、颅内的、眶内的、眼的、心室内的、囊内的、 脊柱内、脑池内、腹膜内的、鼻内的、气雾剂或口服给药方法。配方可 以是液体溶液或悬液；片剂或胶囊；粉末，滴鼻剂或气雾剂形式。
制备所述制剂的方法是本领域公知的(57)。适于非肠道给药的配方可 含有，例如，赋型剂，灭菌水，或盐水，诸如聚乙二醇的聚亚烷基二醇， 植物来源的油，或氢化的萘。也可以采用生物匹配的、生物可降解的交 酯聚合物、交酯/乙交酯聚合物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物来控制所述化 合物的释放。其他潜在的用于调节性化合物非肠道传递的系统包括乙烯- 醋酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的灌注系统以及脂质体。适于 吸入的配方可包括赋型剂，例如乳糖，或可以是含有例如聚氧乙烯-9-月 桂酸酯、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或可以是以滴鼻剂形式给药 的油状溶液或作为凝胶。对治疗性或预防性组合物而言，可以足以中止 或延缓A/E病原体感染的量对个体给药所述化合物。
基于本发明化合物的“有效量”包括治疗有效量或预防有效量。“治 疗有效量”是指在剂量上的有效量，并且在必需的时间阶段内，达到所 需要的治疗结果，例如A/E病原体的聚集或扩散的降低。根据诸如患者 疾病状态、年龄、性别和体重的因素以及所述化合物在患者体内引起所 需要反应的能力不同，所述化合物的治疗有效量也会发生变化。可对剂 量方案进行调节从而提供最适的治疗反应。治疗有效量也可以是所述治 疗有效效果超过了所述化合物的任意毒性或有害效果的量。“预防有效 量”是指在剂量上的有效量，并且在必需的时间阶段内，达到所需要的 预防结果，例如预防由A/E病原体引起的聚集。通常，可在患病之前或 疾病的早期对患者使用预防剂量，所以预防有效量可能低于治疗有效量。 化合物的优选治疗或预防有效量范围可以是从0.1nM-0.1M、 0.1nM-0.05M、0.05nM-15μM或0.01nM-10μM中的任意整数。
需要注意的是所述剂量可随拟被缓解的病症的严重程度不同而变 化。对任意特异的患者而言，可根据个体的需要对特异性的剂量配置， 和给药或监督所述组合物给药的人的职业判断进行调节。在此设定的剂 量范围仅仅是示例性的，而并没有对通过医疗人员选定的剂量范围进行 限制。根据诸如所述个体的疾病状态、年龄、性别和重量的因素，在所 述组合物中的活性化合物的量可以改变。可对剂量方式进行调节从而提 供最适的治疗效果。例如，可给药单粒大丸药，可随时间给药分开的若 干剂量，或可根据所述治疗情况的紧急事件对所述剂量进行成比例的降 低或升高。以剂量单位形式配置非肠道组合物对方便给药和均一剂型相 当有益的。
在疫苗制剂的情况下，可单独或与其他化合物，以及与一种或多种 诱导免疫反应的免疫佐剂来提供本发明的有效量化合物。基于本发明的 佐剂包括乳化剂、胞壁酰二肽、阿夫立定、诸如氢氧化铝的水性佐剂、 基于几丁质的佐剂、皂角苷、油、Amphigen、LPS、细菌细胞壁提取物、 细菌DNA、细菌复合物、合成的寡核苷酸及其组合(100)。所述佐剂可包 括草分支杆菌(M.phlei)细胞壁提取物(MCWE)(美国专利第4,744,984号)， 草分支杆菌DNA(M-DNA)，或分支杆菌细胞壁复合物(MCC)。乳化剂包 括天然或合成的乳化剂。合成的乳化剂包括阴离子试剂(例如，月桂酸和 油酸的钾盐、钠盐和铵盐、脂肪酸的钙盐、镁盐和铝盐、即金属皂、以 及诸如硫酸月桂酸钠的有机磺酸盐)，阳离子试剂(例如，溴化十六烷基三 甲铵)，和非离子试剂(例如，诸如单硬脂酸甘油酯的甘油酯，聚乙二醇酯 和醚，以及诸如脱水山梨聚醇单棕榈酸酯的脱水山梨醇脂肪酸酯，及其 聚氧乙烯衍生物，例如聚氧乙烯脱水山梨聚醇单棕榈酸酯)。天然乳化 剂包括阿拉伯树胶，明胶卵磷脂和胆固醇。其他适合的佐剂包括油，例 如单种油或混合油，水包油乳剂(例如，EMULSIGENTM，EMULSIGEN PLUSTM，或VSA3)，或非水包油乳剂(例如，油性乳剂，油包水乳剂 或水包油包水乳剂)。所述油可以是矿物油，植物油或动物油。适合的 动物油包括例如，鱼肝油，大比目鱼油，鲱油，orange roughy鱼油或 鲨鱼肝油，所有这些油都是可商业获得的。适合的植物油包括但不限 于，菜籽油，杏仁油，棉籽油，玉米油，橄榄油，花生油，红花油， 芝麻油或大豆油。可选择地，多种脂肪族含氮碱可用作所述疫苗制剂 的佐剂。例如，公知的免疫佐剂包括胺，季铵化合物，胍，苄脒和硫 脲阳离子(75)。特异性地佐剂化合物包括溴化二甲基双十八烷铵 (DDA)(美国专利第5,951,988号)(88，59，85，68，84，82，83)和N，N-双十八 烷基-N，N-二(2-羟乙基)丙烷二胺(“阿夫立定”)(美国专利第4,310,550 号，美国专利第5,151,267号)(62)。基于本发明的佐剂还可包括例如矿 物油和溴化二甲基双十八烷铵。
可使包括但不限于混合、超声波和微流化的标准方法来制备疫苗 组合物。所述佐剂可包括疫苗的约10-50％(体积/体积)，或约 20％-40％(体积/体积)或约20％-30％或35(体积/体积)，或这些范围中的 任意值。所述化合物还可连接于载体分子，例如牛血清白蛋白或钥孔 戚血蓝素从而提高免疫原性。
一般地，可在不引起基本毒性的条件下使用本发明的化合物。可使 用标准方法，例如，通过检测细胞培养物或实验动物并测定所述治疗系 数，即LD50(所述种群的50％致死剂量)和LD100(所述种群的100％致死 剂量)之间的比例，测定本发明所述化合物的毒性。然而，在某些情况下， 例如严重的疾病状态下，有必要给药基本过量的所述组合物。
下述实施例仅对本发明的实施方案进行示例性说明，而不应该理解 为对本发明范围的限制。
实施例1
突变体的产生
所使用的细菌菌株如下：EHEC O157:H7菌株86//24(32)，EHEC EDL933(野生型E.coli O127:H7分离物；3)；EHEC escN-(47)，野生型 EPEC E2348/69(野生型E.coli O127:H6分离物；50)，C.rodentium DBS100 (ATCC 51459；53)，REPEC 0103：K-：H285/150(52)，E.coli HB101。
所使用的质粒如下：   质粒 描述和相关表现型   参考文献   pRE118 用于等位基因交换的基于sacB的自杀性载体，Kanr   4   pKD46 质粒表达λ红色重组酶，AMPr   5   pACYC184  克隆载体，CMrTetr   NEB   pCR2.1-TOPO  PCR克隆载体，AmprKanr   Invitrogen   pTOPO-2HA  基于pCR2.1-TOPO，针对C-末端2HA标记的Plac-  驱动的表达盒，AmprKanr   pCRespG-2HA/   BlgII  基于pACYC184，针对C-末端2HA标记的  Citrobacter espG启动子驱动的表达盒，Cmr   pCR1er  pCR2.1-TOPO中的C.rodentium ler   pCRorf11  pCR2.1-TOPO中的C.rodentium orf11/grla   pEGorf11  pCR2.1-TOPO中的EHEC orf11/grlA   pRPorf11  pCR2.1-TOPO中的EPEC orf11/grlA   pKK232-8  含有无启动子cat基因的pBR322衍生物   Pharmacia   pLEE1-CAT  带有C.rodentium LEE1(Ler)-cat转录融合来自核  苷酸-162至+216的pKK232-8衍生物   pLEE5-CAT  带有C.rodentium LEE5(Tir)-cat转录融合来自核苷  酸-262至+201的pKK232-8衍生物
对PCR或反向PCR而言，可使用校对阅读的ELONGASE扩增系统 (GIBCO BRL/Life Technologies)来常规地降低PCR错误率。使用来自 Invitrogen的pCR2，1-TOPO或pCRII-TOPO的TOPO TA克隆试剂盒对 PCR产物进行克隆。使用Taq Dye-terminator方法和自动373A DNA测序 仪(Applied Biosystems)测定DNA序列。对常规克隆，转化和感染而言， 细菌都生长于37℃的Luria-Bertani(LB)琼脂或添加了适当抗生素的培养 基中。可以下列浓度使用多种抗生素，氨苄青霉素100μg/ml，羧苄青霉 素100μg/ml，卡那霉素50μg/ml，和氯霉素30μg/ml。在Dullbecco′s modified Eagle′s培养基(DMEM)中的培养物可用于诱导LEE基因表达和III型蛋白 分泌。
可采用基于sacB基因的等位基因交换(14)和λ红色重组酶系统(17)， 来产生突变体。一般而言，可将每个基因的75％或更多内部成分缺失来 确保所述基因功能的破坏。通过λ红色重组酶方法可对ler基因进行突变， 而通过基于sacB基因的等位基因交换对ler，orf11/grlA和cesT基因进行 了突变。可使用基于sacB基因的等位基因交换产生了ler/orf11双突变体。 在其他地方也描述了tir和escD突变体的产生(20，56)。所述突变体是在 阅读框内缺失的突变体，同时在所缺失的位点上引入了限制酶(NheI， BamHI或SalI)位点，如下：   LEE突变   体名称 蛋白长度(aa)   密码子缺失   (从#到#)   在所述缺失位   点引入的特征   应用的缺失方法   Δler   129   23-97或9-122   NheI或aphT盒   sacB或Lambda   红   Δorf11/grlA   135   23-115   NheI   sacB   ΔescT   156   25-147   NheI   sacB
可通过多重PCR反应对这些突变体进行确证。可通过对各个基因提 供质粒对Δtir，Δler和Δorf11突变体进行互补测验。所有这些突变体都 可以互补，从却确认了通过等位基因交换方法生成的突变并未影响到下 游基因的功能，而且因此是无极性的。
为了制备EHEC-pNleA-HA，使用校正阅读的ELONGASE扩增系统 (Invitreogen)和以下引物Z6024F：5′AGATCTGAAGGAGATATTATGA ACATTCAACCGACCATAC(SEQ ID NO：44)；Z6024R： 5′CTCGAGGACTCTTGTTTCTTCGATTATATCAAAG(SEQ ID NO：45) 对nleA的编码部分进行扩增。使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitreogen)对 PCR产物进行克隆，并使用Taq Dye-terminator方法和自动373A DNA测 序仪(Applied Biosystems)对DNA序列进行确认。然后将所述产物亚克隆 入pCRespG-2HA/BglII，该质粒是工程化后用于驱动C.rodentium EspG 启动子的蛋白表达，并向所述表达的蛋白的C-末端加上两个流感血凝素 (HA)的源自pACYC的质粒。然后通过电穿孔向野生型EHEC和EHEC escN-中导入所述质粒构建体。
通过基于sacB基因的等位基因交换(29)构建了在抗萘啶酸的EHEC 菌株中nleA的缺失突变体。使用EHEC染色体DNA作为模板，对nleA 侧翼的两个DNA片段进行了PCR扩增。
使用引物NT10 5′CCGGTACCTCTAACCATTGACGCACTCG(SEQ ID NO：46)和引物NT11 5′AACCTGCAGAACTAGGTATCTCTAATGCC (SEQ ID NO：47)对片段A进行PCR扩增从而产生了1.3kb的产物。
使用引物NT12 5′AACCTGCAGCTGACTATCCTCGTATATGG(SEQ ID NO：48)和引物NT13 5′CCGAGCTCAGGTAATGAGACTGTCAGC (SEQ ID NO：49)对片段B进行PCR扩增从而产生了1.3kb的产物。
然后用PstI对片段A和B消化1小时，然后将所述酶在65℃加热 失活20分钟。在室温将约50ng的每种消化片段与T4DNA连接酶连接1 小时。将所述连接反应物稀释成1/10，并将1μl加入到使用引物NT10和 NT13的PCR中。将所得的2.3kb PCR产物随后用SacI和KpnI消化，连 接于pRE112的对应位点(14)，并转化入DH5αλpir从而生产pNT225。将 pNT225转化入作为与野生型EHEC轭合的供体菌株的轭合SM10λpir菌 株。在LB琼脂上，可对抗萘啶酸和氯霉素的接合后体(exoconjugation)。 然后将所述接合后体涂布于含有5％(重量/体积)蔗糖而没有NaCl的LB 琼脂上。将所得的克隆随后进行氯霉素敏感性的筛选，然后通过PCR来 鉴定所述分离物具有nleA缺失和质粒序列的缺失。然后分离到nleA缺失 突变体，并将其用于后续工作。使用PCR构建的C.rodentium nleA突变 体可在pRE118(14)中构建含有nleA内部缺失的自杀性载体。
使用了以下引物：del1F 5′GGTACCACCACACAGAATAATC(SEQ ID NO：50)；del1R：5′CGCTAGCCTATATACTGCTGTTGGTT(SEQ ID NO：51)；del2F：5′GCTAGCTGACAGGCAACTCTTGGACTGG(SEQ ID NO：52)；del2R：5′GAGCTCAACATAATTTGATGGATTATGAT(SEQ ID NO：53)。通过电穿孔将所得质粒导入C.rodentium从而构建了具有抗 生素抗性的局部二倍体菌株。如上所述，可对通过第二次重组事件缺失 的质粒序列进行筛选。可使用在所述缺失区域侧翼的引物，通过PCR对 抗生素敏感、抗蔗糖克隆的适当重组事件进行确证。可采用多克隆抗 -NleA抗血清，通过Western杂交对全细胞裂解液中NleA的缺乏进行确 证。
对总蛋白/蛋白质组和分泌蛋白/蛋白质组的分析
如前所述制备了分泌蛋白(51)。
在37℃，在4ml Luria broth(LB)的烧瓶中将C.rodentium菌株过夜生 长。将所述培养物以1∶50接种到在组织培养箱中预孵育(5％CO2)过夜的 4ml Dulbecco′s modified Eagle′s培养基(DMEM)中，在相同的培养箱中静 置生长6小时从而诱导LEE基因表达。将所述培养物在13,000rpm，离 心10分钟，重复两次，从而去除细菌，并用10％三氯乙酸(TCA)沉淀上 清液，从而将分泌入所述培养基中的蛋白浓缩。用2X SDS-PAGE缓冲液 溶解所述细菌沉淀，并将其指定为总细菌蛋白。还可将从所述上清液中 沉淀出的分泌蛋白溶解于2X SDS-PAGE缓冲液，并且用1μl饱和的Tris 中和残留的TCA。将用来重悬所述细菌沉淀和分泌蛋白的缓冲液体积标 准化至所述培养物的OD600，从而确保所述样本的上样是相等的。在12％ 或17％SDS-PAGE，和用0.1％考马斯亮蓝G250染色对所分泌的蛋白进 行分析。对Western杂交分析而言，可使用10％SDS-PAGE对所述总蛋 白或分泌蛋白进行分离，并转移至硝酸纤维素膜上(Bio-Rad)。所使用的 抗体是针对所述His标记的Citrobacter Tir的大鼠多克隆抗体，以及针对 EPEC EspB的小鼠单克隆抗体。按标准的ECL Western杂交实验指南 (Amersham Life Science)进行实验。
在LB培养基中对野生型EHEC和EHEC CVD451进行过夜培养。然 后将培养物以1∶100稀释入添加了44mM NaHCO3、8mM MgSO4、0.4％ 葡萄糖和0.1％酪蛋白氨基酸的M-9基本培养基中，并在37℃在5％CO2中静置生长至OD600为0.6-0.8。
通过在8000g离心30分钟收集分泌蛋白，由此从所述沉淀中分离出 所述上清液。将上清液通过0.45μm的滤器进行过滤，并通过BCA分析 测定蛋白浓度(Sigma)。可通过用1/9体积的100％冷的TCA在冰上沉淀 45-120分钟，然后在17600g离心30分钟制备用于电泳的蛋白。将所述 沉淀在冷的100％丙酮中润洗，并溶解于1X laemmli缓冲液(针对1维 SDS-PAGE凝胶)或针对2D凝胶的2D样本缓冲液(8M尿素，2M硫脲， 4％CHAPS，20mM Tris，0.002％溴酚兰)。对2D凝胶而言，在上样之前 将DTT加至6mg/ml，将IPG缓冲液(pH3-10：Amersham Biosciences)加 至0.5％。将18cm的Immobiline干条(pH3-10：Amersham)在样本中在20℃ 过夜再水化。然后在15℃在65,000Vh对样本进行聚集。聚集之后，将 所述条在EB+10mg/ml DTT中平衡15分钟，然后在EB+25mg/ml碘乙 酰胺中平衡15分钟(EB是50mM Tris，6M尿素，30％甘油，2％SDS， pH8.8)。使用0.5％琼脂糖，在SDS-PAGE电泳缓冲液+0.002％溴酚兰中， 将平衡的条封入大块SDS-PAGE凝胶(12％或14％丙烯酰胺)的顶部，并将 所述凝胶电泳至所述染料前端跑出所述凝胶。
按照制造商的指导(BioRad)，用Sypro Ruby对凝胶染色，在UV看 片灯上进行观察，或通过MS/配备有Nanoflow液相层析系统(LC Packing-Dionex)的LCQ Deca离子捕获质谱(Thermo Finnigan)的MS进行 观察。对在UV看片灯上对凝胶进行观察，可对感兴趣的点进行手工剪 切。根据说明书(23)，在Investigator ProGest Robot(Genomic Solution，安 阿伯，密歇根州)上进行蛋白的凝胶内消化。用配备有FAMOS自动采样 器(LC Packings-Dionex，圣弗朗西斯科，加利福尼亚州)的Nanoflow液相 层析系统，和LCQ Deca离子捕获质谱(Thermo Finnigan，圣何塞，加利 福尼亚州)(24)组成的LC-MS系统对高蛋白丰度的样本进行分析。
使用反相PicoFrit柱PFC7515-PP18-5(New Objective，Woburn，马萨 诸塞州，美国)进行多肽分离，并将所述柱流出物直接喷射到质谱仪中。 使用200nL/分钟的流速，每个样本的总收集时间都为45分钟。
用API QSTAR Pulsar混合MS/配有Nanospray离子源(Proxeon， Odense，丹麦)的MS质谱仪(Applied Biosystems/MDS SCIEX，Concord， 加拿大)(12)对低蛋白丰度的样本进行分析。在分析之前，在 ZipTips(Millipore，Billerica，马萨诸塞州)上对样本进行纯化和浓缩。API QSTAR Pulsar还可用于从头开始的多肽测序。
使用Mascot(Matrixscience)或Sonar(Proteometrics Canada Ltd)搜索引 擎将所得谱在NCBI(Nethesda，马里兰州)数据库中进行搜索。
cat转录融合的构建和CAT分析
将带有所述启动子和所有Citrobacter ler(LEE1)和tir(LEE5)上游调 控元件的PCR片段用Bam HI和Hind III消化，并克隆至含有无启动子 cat基因的质粒pKK232-8。通过所述克隆片段跨越的位置如上所述。可 根据以上描述对不同Citrobacter菌株中的这些融合蛋白指导的CAT活性 进行测定(21，22)。如上所述，在不同时间点从生长于DMEM中的细菌 培养物中收集样本。
序列分析和生物信息学工具
通过BLASTN，TBLASTN和BLASTP进行的DNA和蛋白序列分析 与同源性搜索是使用来自NCBI网站(http://www.ncbi.nih.org/)获得的程序 完成的。所使用的数据库包括NCBI网站，桑格基因组中心 (http://www.sanger.ac.uk/Projects/Microbes)和SwissPort (http://www.expasy.org/sprot/)。可通过IslandPath程序(http://www. pathogenomics.sfu.ca/islandpath/)产生的数据获得LEE PAI的位置和EHEC 基因组中原噬菌体的位置(13)。
Southern杂交分析
使用DNeasy组织试剂盒(Qiagen)制备用于Southern杂交分析的基因 组DNA样本。通过用SalI和BglII酶消化得到500bp的片段，并使用 BrightStar Psoralen-生物素非同位素标记试剂盒(Ambion)对其进行标记及 制备了探针。
用25单位BamHI，EcoRI和PstI对5微克每个基因组DNA样本完 全消化。用1％琼脂糖凝胶将所述样本分离，并通过被动地、轻微的碱性 向下洗脱将其过夜转移至BrightStar-Plus尼龙膜上(Ambion)。通过暴露于 UV光2分钟，然后在80℃烘烤30分钟，对所述DNA交联于所述膜。
通过在10ml ULTRAhyb超敏感杂交缓冲液中(Ambion)在42℃洗涤 30分钟对所述膜进行预杂交。然后向缓冲液中的预杂交膜中加入10微升 制备好的探针，将所述探针与所述膜在42℃杂交过夜。将所述膜在室温 在低严谨洗涤缓冲液中(Ambion)洗涤2次，每次5分钟，然后在高严谨 洗涤缓冲液中(Ambion)洗涤2次，每次15分钟。使用BrightStar BioDetect 非同位素检测试剂盒(Ambion)，然后曝光于Kodak胶片对杂交探针进行 测定。
抗-NleA抗血清的产生
使用以下引物：5′TTCCATATGAACATTCAACCGACC(SEQ ID NO：54)和5′GGAATTCAATAATAGCTGCCATCC(SEQ ID NO：55)将 nleA的编码部分从EHEC基因组DNA中扩增出来，并克隆至his标记的 表达载体(pET28a，Novagen)上。将该质粒导入BL21(λDE3)，生长至光 密度(A600)为0.8，并用0.5mM IPTG在20℃诱导16小时。按照制造商 的指导(Qiagen)，将His标记的蛋白在Ni-NTA柱子中进行纯化。将含有 NleA的组分合并，并加入凝血酶(500∶1)，将所述蛋白在20mM tris pH8.2 和50mM NaCl中透析过夜。次日，将所述蛋白上样于monoQ FPLC柱， 并使用50-500mM线性梯度的NaCl对其进行发展。将含有NleA的组分 合并。这一步骤完成之后所述蛋白的纯度＞90％。使用氟氏完全佐剂 (Sigma)，将纯化的蛋白用来免疫两只雄性Sprague Dawley大鼠，300μg 蛋白/只，按照制造商指南(BioRad)使用活化的免疫亲和支持Affi-Gel 15 对所产生的抗血清进行亲和纯化。对免疫荧光试验而言，可通过用由HeLa 细胞和由EHEC.NleA制备的丙酮粉末进行吸收进一步纯化所述抗血清， 如参考文献45所示。可通过对来自野生型EHEC和EHEC.NleA的细胞 提取物进行Western杂交确定抗血清的特异性。
免疫杂交分析
将用于Western杂交分析的样本通过SDS-PAGE(9％-12％丙烯酰胺) 进行分离。将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，并用含5％无脂奶粉(NFDM) 的pH 7.2、含有0.1％Tween20的TBS(TBST)，在4℃对免疫杂交封闭过 夜，然后用溶于1％NFDM TBST的第一抗体在室温(RT)孵育1小时。将 所述膜在TBST中洗涤6次，然后与1∶5000稀释的辣根过氧化酶轭合的 山羊抗小鼠(H+L)抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)在RT孵 育1小时。使用化学发光检测试剂盒(Amersham)，然后通过曝光于Kodak 胶片(Perkin Elmer)可看到抗原-抗体复合物。使用了以下的第一抗体：抗 -HA.11(Covance)，抗-DnaK(Stressgen)，抗-EHEC Tir，抗-NleA(本研究)， 抗-钙联接蛋白(Stressgen)，抗-钙网织蛋白(Affinity Bioregeants)，抗-微管 蛋白(Sigma)。
免疫荧光
将HeLa细胞生长于24孔组织培养版中的玻璃盖玻片上，并用1μl (EHEC)OD约为0.4的静置过夜培养物感染6小时。在感染后6小时，用 含有Ca2+和Mg2+的PBS洗涤3次细胞，并在室温用含有2.5％多聚甲醛 的PBS固定15分钟。用含有0.1％皂角苷的PBS对细胞进行通透处理， 用含有5％山羊血清或5％BSA的PBS+0.1％皂角苷进行封闭，并在室温 与以下稀释于封闭液中的第一抗体孵育1小时：抗-EHEC Tir，1∶1000； 抗-E.coli O157(Difco)，1∶200；亲和纯化的大鼠多克隆抗-NleA(本研究)， 1∶100；抗-甘露糖苷酶II(由Marilyn Farquhar博士惠赠，UCSD)，1∶1000。 在PBS/皂角苷中洗涤3次之后，将细胞与第二抗体(Alexa-488或-568-轭 合的抗小鼠、兔子、大鼠(Molecular Probes)1∶400)在室温孵育30分钟，用 PBS/皂角苷中洗涤3次，用PBS洗1次，使用mowiol+DABCO将其加 载在玻璃载玻片上。为了能够看到聚合的肌动蛋白，Alexa-488轭合的鬼 笔环肽(Molecular Probes)中包括了以1∶100稀释的第二抗体。当需要时， 将细胞与5μg/ml布雷菲德菌素A(Borhringer Mannheim)在固定前孵育30 分钟。使用Zeiss Axioskop显微镜对图像进行检测，使用Empix DVC 1300 数码相机进行拍摄，使用Northern Eclipase图像软件进行分析，或在 BioRad Radiance Plus共聚焦显微镜上用Lasersharp软件进行检测。
感染宿主细胞的组分分离
对每个样本而言，使用1∶10的初始MOI，用野生型EHEC-pNleA-HA 或EHECescN-pNleA-HA感染两个汇合的100mm培养皿HeLa细胞。在 感染后6小时，用冰预冷的PBS将所述细胞洗涤三次，并使用之前所述 的方法进行生物化学组分分离(30，49)。简言之，用300μL添加了 COPLETE蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的匀浆缓冲液(3mM咪唑，250mM 蔗糖，0.5mM EDTA，pH7.4)重悬所述细胞，并机械性地通过22-G针头 进行破坏。在4℃以低速(3000g)对所述匀浆离心15分钟沉淀未破损的细 胞、细菌、细胞核和细胞骨架成分(低速沉淀)。将上清液在4℃在TLS55 转头在TL100离心机(Beckman)中高速超速离心(41,000g)20分钟，从而将 宿主细胞膜(沉淀)和胞质(上清液)分离。将所述沉淀重悬于300μL 1X laemmli缓冲液，使用5X储存液将所述上清制备成1X laemmli缓冲液。 将等体积的所有组分通过SDS-PAGE(9％丙烯酰胺)分离，并转移至硝酸 纤维素膜进行Western杂交。
对与NleA结合的膜的提取研究而言，使用上述的分离条件将两个 100mm培养皿的感染的HeLa细胞进行各个提取条件的组分分离。将高 速沉淀(宿主膜组分)重悬于300μL以下提取缓冲液中：(i)10mM Tris， 5mM MgCl2，pH 7.4；(ii)10mM Tris，5mM MgCl2，1M NaCl，pH 7.4； (iii)0.2M NaHCO3，5mM MgCl2，pH 11.4；(iv)10mM Tris，5mM MgCl2， 1％Triton X-100pH7.4。在冰上，通过将所述样本每5分钟吸上落下一次 进行30分钟，并将所述样本在100,000g重新离心30分钟。将所述沉淀(不 溶性组成)重悬于300μL laemmli缓冲液，将上清液(可溶性组分)在冰上用 10％三氯乙酸沉淀30分钟，用100％丙酮洗涤，并重悬于300μL laemmli 缓冲液。将等体积的样本通过SDS-PAGE(9％丙烯酰胺)分离，并转移至 硝酸纤维素膜进行Western杂交。
小鼠中C.rodentium的感染分析
按照由英属哥伦比亚大学动物福利委员会和加拿大实验动物使用委 员会提出的指导准则，将5周龄的C3H/HeJ小鼠(Jackson Laboratory)和远 交的NIH Swiss小鼠(Harlan Sprague-Dawley)饲养于英属哥伦比亚大学的 动物房内。将过夜生长于200rpm摇床上的100μL的LB培养基中的野生 型C.rodentium和nleA缺失突变体通过口胃管感染小鼠。通过连续稀释 和涂布滴定接种量，对每一组的计算量为4×108cfu/小鼠。对用C. rodentium感染的高易感性C3H/HeJ小鼠而言，在感染后的每天都要测定 所述感染小鼠的存活情况。一旦任一小鼠表现出濒死状况，就将其立刻 处死。使用NIH Swiss小鼠进行细菌毒力分析，将动物在感染后10天处 死。为了对结肠增生进行评价，收集起始自肛外缘的头4cm的远端结肠， 并在去除了所有粪便之后进行称重。为了对细菌集群进行分析，使用 Polytron组织匀浆器在PBS中将结肠组织和粪便进行匀浆，并在涂布于 MacConkey琼脂(Difco Laboratories)之间进行连续稀释。将结肠组织和粪 便合并来确定在处死时所述小鼠结肠中的总细菌负载。MacConkey琼脂 对革兰氏阴性细菌是具有选择性的，在其上，C.rodentium形成了具有区 别性的且与典型E.coli不同的可鉴定形态学的菌落(26)。为了进行组织学 分析，将所感染小鼠的最后0.5cm结肠固定于10％的中性缓冲的福尔马 林中，进行处理，切成3μm切片，并用苏木精和曙红染色。组织学分析 是在英属哥伦比亚大学的病理学与实验医学系的形态学服务实验室中完 成的。
实施例2
对LEE基因表达调控的分析
为了研究是LEE中的哪个基因对C.rodentium中的LEE表达进行调 控，我们对表达EspB和Tir的LEE突变体进行了分析，所述突变体是分 别由LEE4和LEE5(Tir)操纵子编码的。使用抗-Tir和抗-EspB血清，对生 长于DMEM中的细菌的总细胞裂解物进行了Western杂交分析。我们的 结果证实了Ler在LEE表达中的关键作用，因为在Δler中不产生Tir和 EspB。正如所期望的那样，Δtir和ΔespB也并不产生Tir和EspB。在ΔcesT 中未观察到Tir，这与CesT作为Tir稳定性和分泌的分子伴侣的作用一致 (18，19)。令人惊奇的是，其他LEE编码的蛋白，Orf11，也是Tir和EspB 表达所必需的。Tir和EspB在Δorf11中的表达通过仅带有Citrobacter orf11 的质粒互补(图8)。orf11基因在A/E病原体中是高度保守的，且EHEC 和EPCE orf11都与Citrobacter Δorf11互补(图8)，说明Orf11与A/E病原 体中LEE基因表达的正调控是功能相当的。
序列分析说明Orf11/GrlA与CaiF具有23％一致性，CaiF是肠杆菌 科的cai和fix操纵子的转录激活子，并与由位于std伞毛操纵子下游的 基因编码的未表征沙门氏菌产物的推测的氨基酸序列具有37％一致性 (16)(图7)。这一沙门氏菌同源物在图中用SGH(Salmonella GrlA Homologue)表示。所有这三种蛋白都含有DNA结合蛋白的特征性的预测 的螺旋-转角-螺旋基序。
为了研究Orf11和Ler在调节LEE基因表达中的层次，我们构建了 C.rodentium的ler和orf11双突变体。尽管可通过反式表达Ler部分的恢 复ΔlerΔorf11中Tir和EspB的表达，而类似地表达Orf11则没有这样的 效果(图8)，说明Orf11在调控级联中在Ler上游起作用。通过说明 Citrobacter ler启动子类似于EPEC ler，且其表达在Δorf11中有所降低， 引物扩增分析确证了这样的调控层次。
在生长于DMEM培养基中6小时的Citrobacter WT，Δler和Δorf11 菌株中，通过监测在LEE1(Ler)(pLEE1-CAT)或LEE5(Tir)(pLEE5-CAT)操 纵子以及cat报告基因之间调控区域的转录融合的活性对Orf11在ler表 达中的调控作用进行了进一步的证明。在Δorf11中LEE1-cat融合的活性 有所降低，而在Δler和Δorf11中，LEE5-cat融合的活性则急剧降低。这 些结果说明Orf11是Ler表达的新的阳性调节基因，其随后协助了其他 LEE操纵子的表达。因为Orf11在所述调控级联中在Ler的上游发挥作用， 所以将其命名为GrlA(对LEE-激活子的全部调节剂而言)。
实施例3
LEE编码的TTSS分泌的效应物的鉴定
A/E病原体向组织培养基或基本培养基中分泌了若干种蛋白，但所分 泌的蛋白主要是易位子EspA、EspB和EspD。通过TCA对生长于DMEM 中的细菌上清液进行沉淀，对分泌的蛋白进行了浓缩，并采用12％ SDS-PAGE，然后用考马斯亮蓝染色进行分析。与WT菌株相比，含有 orf11.grlA质粒的C.rodentium分泌了至少300％的EspA、EspB和EspD。
为了对由Citrobacter LEE编码的效应物进行定义，我们用双血凝素 (2HA)抗原决定簇在羧基末端对不涉及TTS和宿主细胞附着的多种LEE- 编码的蛋白进行了标记，并分析了其在WT和C.rodentium中的分泌情况。 在C.rodentium中，只有Tir、EspG、EspF、EspH和Map是LEE-编码的 TTSS分泌的，说明LEE仅编码5种效应物。可通过考马斯染色在具有 Tir分泌大幅提高的突变体中方便地测定出之前未识别的54kDa蛋白 (p54)，说明其代表了在LEE之外编码的的新的推测的效应物。
为了鉴定p54和测定是否在C.rodentium的LEE之外还有其他编码 的效应物，我们利用GrlA能提高LEE基因表达和/或III型分泌的能力， 将grlA质粒引入分泌效应物而不是易位子的突变体中。GrlA的过量表达 极大地增强(超过400％)了Tir在这些突变体中的分泌，同时未分泌出易 位子。观察到了至少6种其他的分泌蛋白，说明LEE-编码的TTSS可分 泌若干其他非LEE-编码的蛋白。
为了鉴定这些蛋白，通过2-D凝胶对所述分泌蛋白进行分析。因为 一些LEE-编码的效应物(EspF，EspH和Map)具有预测的碱性pI值，且 EspF具有11.00的极高pI值，所以这些分泌蛋白被首先聚集于具有酸性 (pH 3-10)和碱性(pH 6-11)梯度的Immobiline干条上，然后分别用12％和 14％的SDS-PAGE解析。用Sypro Ruby对凝胶进行染色，将所选定的蛋 白点手工剪切，并通过质谱和从头多肽测序进行分析。
这样的分析确证了LEE-编码的Tir、EspF、EspG、EspH和Map都 是III型分泌的(表2)。
表2在C.rodentium中由LEE-编码的TTSS分泌的效应物和推测的效应 物  编号   建议   名称   估计的   MW   估计   的pI   基因位   置   在EHEC和其他病原体中的同源物  5   Tir   68   5.0   LEE   Tir，在所有A/E病原体中保守。  10   EspG   44   7.3   LEE   EspG，在所有A/E病原体中保守。  C1&C2   Map   23   9.0   LEE   Map，在所有A/E病原体中保守。  C3   EspF   31   11.0   LEE   EspF，在所有A/E病原体中保守。  C5&C6   EspH   21   8.7   LEE   EspH，在所有A/E病原体中保守。  7   NleA   54   5.8   非LEE   EHEC Z6024在靠近原噬菌体CP-933P   的O-岛71中  12   NleB   39   5.9   非LEE   EHEC Z4328在O-岛122、REPEC LEE-   结合的RorfE和S.typhimurium STMF1   中。还同源于O-岛36的Z0985。  13   NleC   40   4.6   非LEE   EHEC Z0986在靠近原噬菌体   CP-933K的O-岛36中。   14   NleD   28   7.1   非LEE   EHEC Z0990在与Z0985和Z0986在相   同的O-岛36中。还与P.syringae pv.   番茄效应物HopPtoH具有相似性。   17   NleE   27   6.3   非LEE   EHEC Z4329在与Z4328相同的O-岛   122，REPEC LEE-相连的RorfD，和   S.flexneri ORF122。   19   NleF   24   4.7   非LEE   EHEC Z6020，在与Z6024在相同的   O-岛71中。与鼠疫耶氏菌(Yersinia   pestis)和幽门螺旋杆菌(Helicobacter   pylori)的推测蛋白具有一定的相似性。   20   NleG   26   5.8   非LEE   鉴定的多肽序列为：   QQENAPSS(I/L)QTR。在数据库中未   发现同源物。
除了所述五种LEE-编码的效应物，我们还鉴定了7种非LEE-编码的 类似效应物的分泌蛋白。这些由LEE以外编码的分析蛋白因此被指定为 NleA(p54)、NleB、NleC、NleD、NleE、NleF和NleG(QQENAPSS(I/L)QTR； SEQ ID NO：59)(对非LEE编码的效应物而言)，从而将其与LEE编码的分 泌蛋白/效应物(Esp)区别开来(表2)。在这7种鉴定的蛋白中，只有NleG 是C.rodentium唯一的，其他6种蛋白在EHEC O157中都具有高度的保 守同源物(表2)。所述EHEC的同源物是由基因组中集簇在3个不同区域 的基因编码的，每个区域编码至少与C.rodentium分泌蛋白同源的两种蛋 白(表2)。编码NleA和NleF同源物的基因Z6024和Z6020位于与原噬菌 体CP-933P相连的EHEC的O-岛71。类似地，编码NleB和NleE同源 物的基因Z4328和Z4329位于O-岛122，而编码NleC和NleD同源物 (Z0986和Z0990)的基因则位于O-岛36(表2，图9)。此外，Z4328(O-岛 122)与Z0985具有极高的同源性，Z0985是O-岛36中与Z0986相邻的基 因。
所有6种新EHEC效应物基因的同源物在EPEC中都有出现并具有 类似的组织方式，EPEC的基因组已被测序 (http://www.sanger.ac.uk/Projects/Microbes/)。除了Z6024，其表现出与 EPEC基因的89％核苷酸一致性，其他5种EHEC基因都表现出与其在 EPEC中同源物至少95％的一致性。而且，这些效应物中的一些在其他致 病性细菌中也是高度保守的。NleD/Z0990具有与P.syringae pv.番茄的III 型效应物HopPtoH具有相似性(41，42)。NleE/Z4329与兔子EPEC(REPEC) 的RorfD和S.flexneri的Orf212具有显著的同源性(8，33)，而NleB/Z4328 则与REPEC的RorfE和两种推测的S.typhimurium蛋白具有显著的同源 性。Z4328和Z4329基因在EHEC中位置相连，类似于REPEC中rorfD 和rorfE的基因排列(8)。然而，在REPEC中rorfD和rorfE紧邻于LEE， 而其在EHEC中的对应物则存在于远离LEE的区域(O-岛122)。携带有 Z4328和Z4329的EHEC O-岛122还包含编码两种细胞毒素和PagC同源 物的基因，一种S.enterica中重要的PhoP/PhoQ调控的毒力因子(3，43)。 编码这些新效应物的EHEC中的3个O-岛具有二核苷酸倾向和较低的 GC％含量，即PAI的标志(9)。此外，它们或者与原噬菌体相连，或者通 过移动插入序列侧翼于原噬菌体，且并不出现与非致病性E.coli的基因 组中(3)，说明了这些基因的水平转移。综上，这说明了这些岛和新鉴定 的Citrobacter以及EHEC效应物在毒力中的重要性。还说明由于它们之 间各有差异，相关的病原体保持了惊人的保守性PAI组合，尽管PAI的 位置在细菌染色体中是变化的。
实施例4
NleA的鉴定
尽管III型分泌一般认为是接触依赖性的(46)，但确定的体外培养条 件也可在液体培养生长的过程中诱导EHEC将III型效应物分泌至细胞外 培养基中(28，51)。从野生型EHEC(wt)中制备了培养物上清液，并在III 型分泌诱导条件下产生了III型分泌突变体(escN-)。通过SDS-PAGE对所 述分泌蛋白的分析得到了与来自野生型和escN-样本的分泌蛋白类似的 一种丰富的高分子量蛋白，而只有野生型样本存在的其它几种丰富的蛋 白(图10A)。将所分泌的蛋白通过2维凝胶电泳分离，将足量的分离蛋白 点从所述凝胶上剪切下来并通过质谱进行分析(图10B，表I)。
表I   点编号   ID   e值  多肽的#  预测的  mw(kDa)  实验的  mw(kDa)   预测的pI   实验的pI   1   EspP   5.60E-4   4   105   95   5.9   6.5   2a   Tir   2.50E-39   14   58   68   5   5   2b   Tir   2.10E-29   10   58   65   5   4.8   3   NleA   7.70E-11   6   48   50   5   5   4a   EspB   8.60E-53   19   33   38   5.1   5.2   4b   EspB   2.00E-06   2   33   38   5.1   5.1   5   EspA   1.30E-37   16   21   18   4.8   5
在野生型和escN-培养物上清液中出现的#1号点被鉴定为EspP，其 是由不依赖于III型分泌的自动运输机制分泌出的EHEC的质粒编码蛋白 (25)。四种主要的点(#2，3，4，5)是野生型上清液唯一存在的。其中的三 个点被鉴定为公知的LEE中编码的III型分泌蛋白：Tir(#2号点)、EspB(#4 号点)和EspA(#5号点)(图10B，表I)。经过鉴定，#3号点是由EHEC基 因组内LEE之外的开放阅读框编码的预测分子量为48kDa的蛋白(图 10C)。我们将该蛋白称为NleA，即非LEE编码的效应物A。
实施例5
含有nleA座位的表征
nleA基因是在O-岛内编码的，O-岛是非致病性E.coli菌株K-12基 因组中不存在的EHEC基因组部分(3)。在E.coli K-12骨架中保守的最后 一个基因(YciE)和编码噬菌体结构蛋白的基因之间的区域中包含有几个 推测性的转座酶片段和一个推测性的位点特异性重组酶片段(图11A)。使 用Ispandpath，其为鉴定PAI而设计的程序对该区域进行分析(13)，说明 在该区域内的所有ORF都具有二核苷酸倾向和与EHEC基因组平均值不 同的GC含量。该区域内有10个ORF的GC含量比所述EHEC基因组的 平均值低至少一个标准差，而6个ORF中的2个则具有比所述EHEC基 因组的平均值高至少一个标准差的GC含量。综上，这些结果说明nleA 基因归属于含有PAI的水平转移基因。该区域内的几个其他ORF都具有 说明其在发挥毒力作用中的特征，包括推测性的分子伴侣(Z2565)和两种 与其他病原体的III型分泌蛋白类似的蛋白(Z6021，Z6020)。
为了对nleA基因的本质和分布进行深入研究，制备了nleA探针并对 来自其他A/E病原体和非致病性E.coli菌株的基因组DNA板进行了 Southern杂交。如图11B所示，nleA基因存在于所有检测的A/E病原体 中，但不存在于非致病性E.coli中。对进程中的EPEC基因组序列的分 析表明，nleA存在于所述EPEC基因组中噬菌体插入位点的近端。nleA 还存在于紧密粘附素阳性原噬菌体、非O157 EHEC菌株、O84：H4内， 而不存在于非致病性的E.coli菌株和不含有LEE的尿道致病E.coli中。 nleA也不存在于其他含有TTSS的病原体中，例如沙门氏菌属和志贺氏 菌属中。因此，nleA是A/E病原体特异性获得的或保留的。对来自C. rodentium，EPEC，EHEC和O84：H4的nleA基因序列的多重序列比对说 明了在这四种A/E病原体中较高程度的序列保守性(图11C)。
实施例6
NleA是通过LEE编码的III型分泌系统分泌的
迄今为止描述的LEE编码的TTSS的EHEC和EPEC效应物都是在 靠近编码分泌元件本身的基因近端、在LEE之内编码的。为了测定NleA 的分泌是否依赖于LEE编码的TTSS的，在野生型EHEC和缺乏III型分 泌的escN-菌株的质粒中表达了抗原决定簇标记的NleA(47)。如图12A所 示，尽管在野生型和escN-EHEC中HA-标记的NleA的表达水平类似， 但只有NleA-HA-转化的野生型细菌的蛋白分泌到了细胞外培养基中。可 使用非分泌的细菌蛋白，DnaK，作为在分泌蛋白样本中缺乏非分泌蛋白 的对照(图12B)。未转化的和NleA-HA-转化的野生型菌株中分泌Tir，但 escN-菌株不分泌(图12C)，证实了所期望的TTSS表型。在野生型EHEC 和几种EPEC的III型分泌突变体中也观察到了抗原决定簇标记的NleA 表达的类似结果，说明NleA也可通过EPEC TTSS分泌。
实施例7
NleA被易位入宿主细胞中
当EHEC生长于III型分泌诱导条件下时，有两种蛋白分泌到了细胞 外培养基中。为了测定NleA是否是易位体或易位效应物，我们通过产生 缺失突变菌株研究了在缺乏NleA条件下的III型分泌和易位。分析了来 自野生型和ΔnleA突变体EHEC菌株的分泌蛋白谱。野生型样本中含有 ΔnleA分泌蛋白中没有的约50kDa的丰富的蛋白(图13A)。用针对NleA 的抗血清进行Western杂交证明了野生型分泌蛋白样本中存在有50kDa 的NleA，而不存在于ΔnleA样本(图13B)。然而，无论存在或不存在NleA， 野生型和ΔnleA菌株的分泌蛋白谱都是一致的(图13A)。因此，并不需要 NleA来分析其他III型分泌效应物。为了测定是否需要NleA来完成其他 III型效应物进入宿主细胞的易位，使用野生型EHEC和EHEC ΔnleA感 染了HeLa细胞，并通过对感染细胞进行免疫荧光染色监测Tir的易位和 功能。通过将感染的细胞进行抗-EHEC和抗-Tir抗体的免疫荧光，并用 毒伞素使纤维状肌动蛋白成为可见，对野生型EHEC和ΔnleA突变体的 基架形成进行了测定。所述结果说明EHEC ΔnleA附着于HeLa细胞的水 平与野生型EHEC相当。免疫荧光染色说明Tir易位进入了宿主细胞，并 集中在感染的野生型和ΔnleA EHEC菌株的细菌下。为了确证功能性的 Tir易位，用荧光毒伞素对感染的细胞进行染色，从而使得在附着细菌之 下涉及基架形成中的聚合的肌动蛋白成为可见。在感染了野生型或ΔnleA EHEC的细胞中出现的肌动蛋白基架，说明了可在缺乏NleA的情况下实 施其他III型效应物的易位和功能。这些结果也说明不需要NleA来完成 基架形成。
由于NleA并未表现出在其他效应物的分泌和易位中具有作用，我们 需要研究是否NleA会自我易位。用野生型EHEC或表达HA-标记的NleA 的escN-EHEC感染HeLa细胞6小时，将其用于亚细胞组分分离，并用 抗-HA抗体进行Western杂交分析。如图14A所示，NleA易位进入宿主 细胞，在那里其与宿主细胞膜组分相结合。在使用表达HA-标记的NleA 的III型分泌突变体感染细胞的过程中未观察到NleA的易位，说明NleA 易位与宿主膜结合是TTSS依赖的。使用与每种组分的特异性蛋白结合的 抗体对所述组分进行的Western杂交确证了不存在所述组分的交叉污染。 钙联接蛋白，一种宿主细胞整合的膜蛋白，并不存在于宿主细胞质组分 中；微管蛋白，一种宿主细胞细胞质蛋白，也不存在于宿主膜组分中。 DnaK，一种非分泌的细菌蛋白，仅存在于低速沉淀中，说明没有宿主细 胞膜和胞质组分的细菌污染。由于EHEC附着的III型依赖性，NleA和 DnaK都不存在于III型突变体感染细胞的低速沉淀中。为了对因EHEC 附着的III型依赖性而产生的III型突变体感染样本中的NleA人工缺乏进 行控制，我们还用野生型或III型突变体EPEC进行了类似实验来表达和 传递NleA-HA，因为EPEC对HeLa细胞的附着是不依赖于III型分泌的。 NleA存在于用野生型感染，而不存在于用III型突变体EPEC菌株的细胞 感染的膜组分中。NleA和DnaK存在于野生型和III型突变体EPEC感染 细胞的低速沉淀中。
为了研究NleA与宿主细胞膜结合的本质，在冰上，在若干条件下可 对含有HA-标记的NleA的感染的宿主细胞膜组分进行提取，并离心从而 获得可溶性和不溶性的膜组分(图14B)。将这些组分使用抗-HA抗体的 Western杂交分析来测定HA-标记的NleA。用高盐(1M NaCl)或碱性 pH(0.2M Na2CO3，pH 11.4)处理分别去除通过静电或亲水相互作用的与外 周膜结合的蛋白。NleA与宿主细胞膜的结合可以抵抗这些处理的破坏(图 14B，顶部嵌图)，钙联接蛋白，一种整合膜蛋白也如此(图14B，中部嵌 图)。相反，可在高盐和碱性处理中从所述膜组分中提取出大部分的钙网 织蛋白，其是一种外周膜蛋白(图14B，底部嵌图)。用溶解诸如钙联接蛋 白的整合膜蛋白的非离子去污剂Triton X-100对膜组分进行处理(图14B， 中图)，几乎完全的溶解了NleA，导致了所述HA-标记的NleA蛋白从不 溶组分迁移到了可溶组分(图14B，顶部嵌图)。这些结果说明NleA易位 进入宿主细胞，在那里其可作为整合的膜蛋白。实际上，通过若干跨膜 结构域预测程序对所述NleA蛋白序列的分析在该序列中预测出了一个 或两个推断性的跨膜结构域(图11C)。
实施例8
NleA定位于宿主的高尔基体
随后测定了宿主细胞内NleA的亚细胞定位。用野生型EHEC或 EHEC ΔnleA感染HeLa细胞，并用针对于NleA和甘露糖苷酶II的抗体 进行免疫荧光。在固定前，可用布雷菲德菌素A对某些样本处理30分钟。 采用NleA和甘露糖苷酶II染色的双色覆盖法。用编码GFP-NleA融合蛋 白的表达构建体转染HeLa细胞，并使用针对甘露糖苷酶II的抗体进行 免疫荧光。
使用抗-NleA抗体，对野生型EHEC感染的HeLa细胞进行免疫荧光 染色，得到了在用EHEC ΔnleA感染的细胞或未感染细胞中都没有的核周 染色图谱。这样的图谱并不类似于用适于晚期内涵体、溶酶体、内质网、 线粒体或细胞核的标记得到的染色。然而，当用抗-NleA和针对高尔基体， 包括甘露糖苷酶II的标记的抗体对细胞进行共染色时，得到了非常类似 的染色图谱，其中所述两种蛋白的共定位相当广泛。为了确证NleA定位 于高尔基体，在固定前，将感染的细胞与破坏高尔基体结构的真菌代谢 物布雷菲德菌素A孵育(27)，并进行免疫荧光。正如对高尔基体定位的 蛋白所期望的那样，布雷菲德菌素A处理导致了甘露糖苷酶II和NleA 染色的扩散。观察到了NleA与几种其它高尔基体标记的共定位，而在使 用HA和FLAG抗原决定簇标记的抗-标记抗体，对测定抗原决定簇标记 的NleA染色进行的实验中也观察到了高尔基体的定位。为了测定NleA 定位于高尔基体是否还需要其它的细菌因子还是NleA的固有性质，用编 码GFP-NleA融合蛋白的表达构建体对细胞进行了转染。转染的NleA GFP同样定位于高尔基体，其在那里与甘露糖苷酶II的染色重叠。
因此，我们的结果说明NleA定位于高尔基体。所观察到的转化的 GFP-NleA融合蛋白定位于高尔基体说明，NleA蛋白含有高尔基体靶位 信息，而不需要其它细菌因子来达到这一目的地。细菌传递的NleA也是 高尔基体定位的。
实施例9
NleA是毒力必需的
在A/E病原体中NleA的高度序列保守性(图11C)说明NleA在感染 中具有类似作用。C.rodentium是小鼠的天然病原体(53)，并本用作研究 A/E发病机理的模型系统。在易感菌株中，C.rodentium感染是致命的， 并通常在感染的6-10天导致感染小鼠的死亡(54)。更具有抗性的小鼠品 系并不会由于C.rodentium感染而死亡，但会变成寄居的并发展成肠炎症 和结肠增生(54)。
为了测定NleA在毒力中的作用，我们构建了nleA-缺失的C. rodentium菌株，并通过用NleA抗血清对总细菌提取物进行Western杂交 证明了不存在NleA(图16A)。通过口胃管用等量的野生型或ΔnleA细菌 感染小鼠。在C.rodentium-易感性C3H-HeJ小鼠中，NleA是毒力必需的。 所有感染了野生型C.rodentium的C3H-HeJ小鼠(n＝9)在感染的6-10天后 全部死亡，而所有ΔnleA-感染的小鼠(n＝13)则表现出一些较轻的疾病症 状，例如软便，但依然在增重，且在整个感染过程中都比较活跃，并具 有无限定的成活率(图16B)。而且，所述ΔnleA-感染的小鼠能够抵抗随后 用野生型C.rodentium进行的刺激(n＝5，图16B)。因此，尽管ΔnleA菌株 在易感小鼠中是非致病性的，但其也足以与宿主相互作用从而刺激保护 性免疫。
与C3H-HeJ小鼠相反，C.rodentium感染对远交的NIH Swiss小鼠并 不是致命的。在这些小鼠中，在大肠的C.rodentium寄居导致了肠炎症， 结肠增生和轻微的腹泻症状。用野生型C.rodentium或ΔnleA菌株感染 NIH Swiss小鼠，并在感染后10天处死。在第10天，用ΔnleA菌株感染 的小鼠，平均比用C.rodentium感染的小鼠在结肠中的滴度低20倍(图 16C)。
通过用野生型C.rodentium或ΔnleA菌株感染，并在感染后10天处 死动物，对感染的NIH Swiss小鼠的结肠进行了组织学分析。将所感染小 鼠的最后0.5cm结肠固定于10％的中性缓冲的福尔马林中，进行处理， 切成3μm切片，并用苏木精和曙红染色。使用5X和63X物镜对所有小 鼠的组织切片进行观察和照相。其结果说明，在来自感染小鼠肛外缘的 的活组织切片检查组织学分析中，在野生型感染的组织中可见无数的细 菌，而在ΔnleA感染的样本中细菌数要稀少的多。所有感染了野生型C. rodentium的动物都表现出结肠增生的病理信号，而所有ΔnleA感染的小 鼠都没有增生的信号。所述野生型感染的样本表现出了严重的炎症和增 生，其程度达到了肠腔不再明显，且外肌肉层可见扩张，从而容纳体积 增大的上皮细胞。相反，ΔnleA感染的样本却表现出相对正常的组织学。 在两组小鼠中，还观察到了在处死时的结肠重量的不同，以及肠炎症和 增生的相对程度的不同(图16D)。正如脾重量所反映出的，野生型感染的 小鼠具有比ΔnleA感染的小鼠增大的脾(图16D)。
因此，我们证明了NleA在小鼠疾病模型中对毒力的重要影响。在易 感小鼠中，在C.rodentium中功能性NleA的存在可在10天之内导致致 命感染。感染了缺乏NleA菌株的小鼠几乎没有症状并在感染后具有无限 定的存活。在更有抗性的小鼠品系中，C.rodentium感染是不致命的，NleA 是结肠增生的发展所必需的，且在感染第10天时，在宿主肠道中出现了 较少的nleA突变体细菌。这些研究说明了NleA在C.rodentium的毒力中 具有明显的作用。我们来自HeLa细胞EHEC感染的结果证明，在体外， NleA并不影响细菌对宿主细胞的附着或者是其他效应物的易位，这说明 NleA可在抵抗宿主清除的水平上具有作用，而不是提高细菌的附着。此 外，ΔnleA感染的小鼠对随后用野生型C.rodentium刺激的抵抗也证明， nle突变体菌株寄居于宿主和与宿主的相互作用足以刺激宿主的免疫。这 与C.rodentium的III型突变体相反，其并不寄居于宿主，也并会为随后 的刺激提供保护。因此，ΔnleA突变体菌株可用作弱化的疫苗菌株。
参考文献
将以下出版物全文包括作用参考。
1.Nataro，J.P.，和Kaper，J.B.(1998)Diarrheagenic Escherichia coli(腹 泻性大肠杆菌).Clin Microbiol Rev 11：142-201。
2.Frankel，G.，Phillips，A.D.，Rosenshine，I，Dougan，G.，Kaper， J.B.，和Knutton，S.(1998)Enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli：more subversive elements(致肠病和肠出血性大肠杆菌： 更多破坏性元素).Mol Microbiol 30：911-921.
3.Perna，N.T.，Plunkett，G.，3rd，Burland，V.，Mau，B.，Glasner， J.D.，Rose，D.J.，Mayhew，G.F.，Evans，P.S.，Gregor，J.，Hirkpatrick， H.A.，Posfai，G.，Hackett，J.，Klink，S.，Boutin，A.，Shao，Y.， Miller，L.，Grotbeck，E.J.，Davis，N.W.，Lim，A.，Dimalanta， E.T.，Potamousis，K.D.，Apodaca，J.，Anantharaman，T.S.，Lin，J.， Yen，G.，Schwartz.D.C.，Welch，R.A.，和Blattner，F.R.(2001)Genome sequence of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7(肠出血性大肠 杆菌O157:H7的基因组序列).Nature 409：529-533.
4.Elliott，S.J.，Wainwright，L.A.，McDaniel，T.K.，Jarvis，K.G.， Deng，Y.K.，Lai，L.C.，McNamara，B.P.，Donnenberg，M.S.，和Kaper， J.B.(1998)The complete sequence of the locus of enterocyte effacement (LEE)from enteropathogenic Escherichia coli E2348/69(来自肠出血性大肠 杆菌E2348/69的肠上皮细胞消失座位(LEE)的全序列).Mol Microbiol 28：1-4.
5.Perna，N.T.，Mayhew，G.F.，Posfai，G.，Elliott，S.，Donnenberg， M.S.，Kaper，J.B.，和Blattner F.R.(1998)Molecular evolution of a pathogenicity island from enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7(来 自肠出血性大肠杆菌O157:H7的毒力岛的分子进化).Infect Immun 66： 3810-3817.
6.Zhu，C.，Agin，T.S.，Elliott，S.J.，Johnson，L.A.，Thate， T.E.，Kaper，J.B.，和Boedeker，E.C.(2001)Complete nucleotide sequence and analysis of the locus of enterocyte Effacement from rabbit diarrheagenic Escherichia coli RDEC-1(兔腹泻性大肠杆菌RDEC-1肠上皮细胞消失座 位的全核酸序列与分析).Infect Immun 69：2107-2115.
7.Deng，W.，Li，Y.，Vallance，B.A.，和Finlay，B.B.(2001)Locus of enterocyte effacement from Citrobacter rodentium：sequence analysis and evidence for horizontal transfer among attaching and effacing pathogens(来 自Citrobacter rodentium的肠上皮细胞消失座位：序列分析与在附着和消 失病原体中横向转移的证据).Infect Immun 69：6323-6335.
8.Tauschek，M.，Strugnell，R.A.，和Robins-Browne，R.M.(2002) Characterization and evidence of mobilization of the LEE pathogenicity island of rabbit-specific strains of enteropathogenic Escherichia coli(兔特异 性致肠病大肠杆菌菌株的LEE致病岛迁移的表征和证据).Mol Microbiol 44：1533-1550.
9.Hacker，J.，和Kaper，J.B.(2000)Pathogenicity islands and the evolution of microbes(微生物的致病岛和进化).Annu Rev Microbiol 54： 641-679.
10.G.R.Cornelis，J.Cell.Biol.158：401(2002).
11.S.Gruenheid，B.B.Finlay，Nature 422，775(2003).
12.Chernushevich，A.Loboda，B.Thomson，J.Mass Spectrom.36，849 (2001).
13.Hsiao，W.，Wan，I.，Jones，S.J.，和Brinkman F.S.(2003) IslandPath：aiding detection of genomic islands in prokaryotes(IslandPath： 协助在原核生物中测定基因岛).Bioinformatics 19：418-420.
14.Edwards，R.A.，Keller，L.H.，和Schifferli，D.M.(1998)Improved allelic exchange vectors and their use to analyze 987P fimbria gene expression(改进的等位基因交换载体及其用于分析987P伞毛基因表达). Gene 207：149-157.
15.V.Sperandio，J.L.Mellies，W.Nguyen，S.Shin，J.B.Kaper，Proc Natl.Acad.Sci.USA 96，15196(1999).
16.J.L.Mellies，S.J.Elliott，V.Sperandio，M.S.Donnenberg，J.B. Kaper，Mol.Microbiol.33，296(1999).
17.K.A.Datsenko，B.L.Wanner，Proc Natl.Acad.Sci.USA 97，6640 (2000).
18.A.Abe等人，Mol Microbiol.33，1162(1999)..
19.S.J.Elliott等人，Mol Microbiol.33，1176(1999).
20.Vallance，B.A.，Deng，W.，De Grado，M.，Chan，C.，Jacobson， K.，和Finlay，B.B.(2002b)Modulation of inducible nitric oxide synthase expression by the attaching and effacing bacterial pathogen Citrobacter rodentium in infected micE(在感染的micE中附着和消失细菌病原体 Citrobacter rodentium对可诱导的一氧化氮合成酶表达的调控).Infect Immun 70：6424-6435.
21.V.H.Bustamante，F.J.Santana，E.Calva，J.L.Puente，Mol. Microbiol.39，664(2001).
22.J.L.Puente，D.Bieber，S.W.Ramer，W.Murray，G.K.Schoolnik， Mol.Microbiol.20，87(1996).
23.T.Houthaeve，H.Gausepohl，M.Mann，K.Ashman，FEBS Lett.376， 91(1995).
24.Z.Ziegler，Anal.Chem.74，489A(2002).
25.Brunder，W.，Schmidt，H.和Karch，H.(1997)EspP，a novel extracellular serine protease of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157: H7 cleaves human coagulation factor V(EspP，能够剪切人凝血因子V的肠 出血性大肠杆菌O157:H7的新的细胞外丝氨酸蛋白酶).Mol.Microbiol. 24：767-778.
26.Buchet，A.，Nasser，W.，Eichler，K.，和Mandrand-Berthelot， M.A.(1999)Positive co-regulation of the Escherichia coli carnitine pathway cai and fix operons by CRP and the CaiF activator(通过CRP和CaiF激活子 对大肠杆菌肉碱途径cai和fix操纵子的正共调控).Mol.Microbiol.34： 562-575.
27.Chardin，P.，和McCormick，F.(1999)Brefeldin A：the advantage of being uncompetitive(布雷菲德菌素A：非竞争性的优势).Cell 97： 153-155.
28.DeVinney，R.，Stein，M.，Reinscheid，D.，Abe，A.，Ruschkowski， S.，和Finlay，B.B.(1999)Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 produces Tir，which is translocated to the host cell membrane but is not tyrosine phosphorylated(肠出血性大肠杆菌O157:H7产生了Tir，其易位 进入宿主细胞膜，但并未被酪氨酸磷酸化).Infect Immun 67：2389-2398.
29.Donnenberg，M.S.，和Kaper，J.B.(1991)Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector(通过使用阳性选择的自杀性载体构建致 肠病大肠杆菌的eae缺失突变体).Infect Immun 59：4310-4317.
30.Gauthier，A.，de Grado，M.，和Finlay，B.B.(2000)Mechanical fractionation reveals structural requirements for enteropathogenic Escherichia coli Tir insertion into host membranes(机械性组分分离说明了致肠病大肠 杆菌Tir插入宿主细胞膜的结构需要).Infect Immun 68：4344-4348.
31.Goosney，D.L.，DeVinney，R.，和Finlay，B.B.(2001)Recruitment of cytoskeletal and signaling proteins to enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli pedestals(对致肠病和肠出血性大肠杆 菌基架的细胞骨架和信号蛋白的募集).Infect Immun 69：3315-3322.
32.Griffin，P.M.，Ostroff，S.M.，Tauxe，R.V.，Greene，K.D.， Wells，J.G.，Lewis，J.H.，和Blake，P.A.(1988)Illnesses associated with Escherichia coli O157:H7 infections.A broad clinical spectrum(与大肠杆菌 O157:H7相关的疾病，广泛的临床谱).Ann Intern Med 109：705-712.
33.C.Buchrieser等人，Mol Microbiol.38，760(2000).
34.Galan，J.E.(2001)Salmonella interactions with host cells：type III secretion at work(沙门氏菌与宿主细胞的相互作用：工作时的III型分泌). Annu Rev Cell Dev Biol 17：53-86.
35.Kenny，B.，DeVinney，R.，Stein，M.，Reinscheid，D.J.， Frey，E.A.，和Finlay，B.B.(1997)Enteropathogenic E.coli(EPEC) transfers its receptor for intimate adherence into mammalian cells(致肠病大 肠杆菌(EPEC)将其用于紧密附着的受体转移至哺乳动物细胞中).Cell 91：511-520.
36.Elliott，S.J.，Krejany，E.O.，Mellies，J.L.，Robins-Browne， R.M.，Sasakawa，C.，和Kaper，J.B.(2001)EspG，a hovel type III system- secreted protein from enteropathogenic Escherichia coli with similarities to VirA of Shigella flexneri(EspG，与弗氏志贺菌的VirA具有相似性的来自 致肠病大肠杆菌的新的III型系统分泌蛋白).Infect Immun 69：4027-4033.
37.Kenny，B.，和Jepson，M.(2000)Targeting of an enteropathogenic Escherichia coli(EPEC)effector protein to host mitochondria(致肠病大肠杆 菌(EPEC)效应物蛋白对宿主线粒体的靶向).Cell Microbiol 2：579-590
38.McNamara，B.P.，Koutsouris，A.，O’Connell，C.B.，Nougayrede， J.P.，Donnenberg，M.S.，和Hecht，G.(2001)Translocated EspF protein from enteropathogenic Escherichia coli disrupts host intestinal barrier function(来 自致肠病大肠杆菌的易位EspF蛋白破坏了宿主的肠屏障功能).J Clin Invest 107：621-629.
39.O.Marches等人，Infect.Immun 68，2171(2000).
40.Tu，X.，Nisan，I.，Yona，C.，Hanski，E.，和Rosenshine，I.(2003) EspH，a new cytoskeleton-modulating effector of enterohaemorrhagic and enteropathogenic Escherichia coli(EspH，肠出血性和致肠病大肠杆菌的新 的细胞骨架调控效应物).Mol Microbiol 47：595-606.
41.D.S.Guttman等人，Science 295，1722(2002).
42.T.Petnicki-Ocwjeja等人，J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，7652 (2002).
43.S.Miller，A.M.Kukral，J.J.Mekalanos，J.Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86，5054(1989).
44.Gruenheid，S.，DeVinney，R.，Bladt，F.，Goosney，D.， Gelkop，S.，Gish，G.D.，Pawson，T.，和Finlay，B.B.(2001) Enteropathogenic E.coli Tir binds Nck to initiate actin pedestal formation in host cells(致肠病大肠杆菌的Tir结合于Nck从而启动了宿主细胞中的肌 动蛋白基架形成).Nat Cell Biol 3：856-859.
45.Harlow，E.，和Lane，D.(1988)Antibodies：a laboratory manual (抗体：实验室手册).Cold Spring Harbor，NY：Cold Spring Harbor Laboratory.
46.Hueck，C.J.(1998)Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants(动物和植物细菌病原体中的III型蛋白分 泌系统).Microbiol Mol Biol Rev 62：379-433.
47.Jarvis，K.G.，和Kaper，J.B.(1996)Secretion of extracellular proteins by enterohemorrhagic Escherichia coli via a putative type III secretion system(通过推测型III型分泌系统的肠出血性大肠杆菌的细胞 外蛋白的分泌).Infect Immun 64：4826-4829.
48.Kenny，B.，Ellis，S.，Leard，A.D.，Warawa，J.，Mellor， H.，和Jepson，M.A.(2002)Co-ordinate regulation of distinct host cell signalling pathways by multifunctional enteropathogenic Escherichia coli effector molecules(通过多功能致肠病大肠杆菌效应物分子对不同宿主细 胞信号途径的共协调调控).Mol Microbiol 44：1095-1107.
49.Knodler，L.A.，Vallance，B.A.，Hensel，M.，Jackel，D.， Finlay，B.和Steele-Mortimer，O.(2003)Salmonella type III effectors PipB and PipB2 are targeted to detergent-resistant microdomains on internal host cell membranes(沙门氏菌III型效应物PipB和PipB2被靶定于宿主内细胞 膜上的抗去污剂的微区域).Mol Microbiol 49：685-704.
50.Levine，M.M.，Bergquist，E.J.，Nalin，D.R.，Waterman， D.R.B.，Hornick R.B.，Young，C.R.，和Sotman，S.(1978)Escherichia coli strains that cause diarrhoea but do not produce heat-labile or heat-stable enterotoxins and are non-invasive(引起腹泻但不产生不耐热热或耐热肠毒 素的大肠杆菌菌株是非侵入性的).Lancet 1：1119-1122.
51.Li，Y.，Frey，E.，Mackenzie，A.M.，和Finlay，B.B.(2000)Human response to Escherichia coli O 157：H7 infection：antibodies to secreted virulence factors(人对大肠杆菌O157:H7感染的反应：对分泌毒力因子 的抗体).Infect Immun 68：5090-5095.
52.Peeters，J.E.，Geeroms，R.，和Orskov，F.(1988)Biotype，serotype， and pathogenicity of attaching and effacing enteropathogenic Escherichia coli strains isolated from diarrheic commercial rabbits(从腹泻的商业兔子中分 离的附着和消除致肠病大肠杆菌菌株的生物型、血清型和致病性).Infect Immun 56：1442-1448.
53.Schauer，D.B.，和Falkow，S.(1993)The eae gene of Citrobacter fruendii biotype 4280 is necessary for colonization in transmissible murine colonic hyperplasia(Citrobacter fruendii生物型4280的eae基因是转移行鼠 结肠增生的寄居所必需的).Infect Immun 61：4654-4661.
54.Vallance，B.A.，Deng，W.，Jacobson，K.，和Finlay，B.B.(2003) Host susceptibility to the attaching and effacing bacterial pathogen Citrobacter rodentium(对附着和消除细菌病原体Citrobacter rodentium的 宿主易感性).Infect Immun 71：3443-3453.
55.Yoshida，S.，Katayama，E.，Kuwae，A.，Mimuro，H.，Suzuki， T.，和Sasakawa，C.(2002)Shigella deliver an effector protein to trigger host microtubule destabilization，which promotes Racl activty and efficient bacterial internalization(志贺氏菌将效应物传递引发宿主微管蛋白不稳定 的效应物蛋白，其增强了Rac1的活性和有效的细菌内在化).Embo J21： 2923-2935.
56.Deng，W.，Vallance，B.A.，Li，Y.，Puente，J.L.，和Finlay， B.B.(2003)Citrobacter rodentium translocated intimin receptor(Tir)is an essential virulence factor needed for actin condensation，intestinal colonization and colonic hyperplasia in micE(Citrobacter rodentium易位的 紧密粘附素受体(Tir)是小鼠中肌动蛋白浓缩、肠聚集和结肠增生必需的 主要毒力因子).Mol Microbiol 48：95-115.
57.″Remington′s Pharmaceutical Sciences″(19th edition)，ed.A. Gennaro，1995，Mack Publishing Company，Easton，Pa..
58.Abe，A.，U.Heczko，R.Hegele，和B.Finlay.1998.Two enteropathogenic Escherichia coli type III secreted proteins，EspA and EspB， are virulence factors(两种肠致病性大肠杆菌III型分泌蛋白EspA和EspB 都是毒力因子).Journal of Experimental Medicine 188：1907-1916.
59.Adv.DrugDeliv.Rev.5(3)：163-187(1990).
60.Altschul，S.F.1991.Amino acid substitution matrices from an information theoretic perspective(来自信息理论看法的氨基酸替换矩阵). Journal of Molecular Biology，219：555-665.
61.Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生 物学技术)，John Wiley & Sons，New York，N.Y.，1998.
62.Babiuk等人，(1986)Virology 159：57-66).
63.Beuzon，C.R.，和D.W.Holden.2001.Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo(通 过应用沙门氏菌株的混合感染来研究毒力基因及其体内的相互作用). Microbes Infect 3：1345-52.
64.Brown D等人，(2002)TechNotes 9：3-5.
65.Brummelkamp TR等人，(2002)Science 296：550-553.
66.Canil，C.，I.Rosenshine，S.Ruschkowski，M.S.Donnenberg，J. B.Kaper，和B.B.Finlay.1993.Enteropathogenic Escherichia coli decreases the transepithelial electrical resistance of polarized epithelial monolayers(致 肠病的大肠杆菌降低了极化上皮单层细胞的经上皮电阻).Infect Immun 61：2755-62.
67.Caplen NJ等人，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：9746-9747.
68.Clin.Exp.Immunol.78(2)：256-262(1989).
69.Cloning Vectors：A Laboratory Manual(克隆载体：实验室指南)(P. H.Pouwels等人1985，Supp.1987).
70.Dayhoff，M.O.，Schwartz，R.M.，Orcutt，B.C.1978.″A model of evolutionary change in proteins.″In″Atlas of Protein Sequence and Structure″(“蛋白序列和结构地图”中的“蛋白进化改变的模型”).5(3)M. O.Dayhoff(编辑)，345-352，国家生物医学研究基金会，华盛顿.
71.Eisenberg等人，J.Mol.Bio.179：125-142，184.
72.Elder等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97：2999.
73.Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology(分子 生物学方法中的抗原决定簇作图方法)，66卷，(Glenn E.Morris，编辑， 1996)Humana Press，Totowa，NJ.
74.Fey等人，Emerg.Infect.Dis.(2000)第6卷.
75.Gall，D.(1966)Immunology 11：369-386.
76.Geysen等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002.
77.Geysen等人，(1986)Molec.Immunol.23：709-715.
78.Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas(关于单克隆抗体和T细胞杂交瘤)，Elsevier，N.Y.，1981.
79.Hammond SM等人，(2001)Nature Rev Gen 2：110-119.
80.Hauf，N.，和T.Chakraborty.2003.Suppression of NF-kappa B activation and proinflammatory cytokine expression by Shiga toxin-producing Escherichia coli(由产志贺氏毒素大肠杆菌导致的对NF-kappa B活化的 抑制和促炎症反应细胞因子的表达).J Immunol 170：2074-82.
81.Hopp等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1981)78：3824-3828.
82.Immunology 58(2)：245-250(1986).
83.Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.68(3)：201-208(1982).
84.J Immunol.Methods 97(2)：159-164(1987).
85.J.Controlled Release 7：123-132(1988).
86.Karlin，S.和Altschul，S.F.1990.″Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes″(“通过使用普通评分方式对分子序列特征的统计学显著 性进行分析的方法”)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87：2264-2268.
87.Knodler，L.A.，J.Celli，W.D.Hardt，B.A.Vallance，C.Yip和 B.B.Finlay.2002.Salmonella effectors within a single pathogenicity island are differentially expressed and translocated by separate type III secretion systems(在单个致病岛内沙门氏菌效应物是通过分离的III型分泌系统不 同表达和易位的).Mol Microbiol 43：1089-103.
88.Kodak Laboratory Chemicals Bulletin 56(1)：1-5(1986).
89.Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976.
90.Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976.
91.Kohler等人，Nature 256：495，1975.
92.Kyte等人，J：Mol.BioL(1982)157：105-132).
93.Lee NS等人，(2002)Nature Biotechnol.20：500-505.
94.M.S.Johnson和J.P.Overington.1993.A Structural Basis of Sequence Comparisons：An evaluation of scoring methodologies.(序列比较 的结构基础：对评分方法学的评估).Journal of Molecular Biology.233： 716-738.
95.Miyagishi M和Taira K.(2002)Nature Biotechnol 20：497-500.
96.Mvers和Miller，CABIOS，1989，4：11-17.
97.Naylor，S.W.，J.C.Low，T.E.Besser，A.Mahajan，G.J.Gunn， M.C.Pearce，I.J.D.G.Smith和D.L.Gally.2003.Lymphoid follicle-dense mucosa at the terminal rectum is the principal site of colonization of enterohemorrhagic Escherichia coli O 157：H7in the bovine host(直肠末端淋 巴小结密度增高的粘膜是在牛宿主中肠出血性大肠杆菌O157:H7聚居 的主要位点).Infect Immun 71：1505-12.
98.Paddison PJ等人，(2002).Genes & Dev.16：948-958.
99.Paul CP等人，(2002)Nature Biotechnol.20：505-508.
100.Schijns等人，Curr.Opi.Immunol.(2000)12：456.
101.Sharp PA.(2001)Genes Dev 15：485-490.
102.States，D.J.，Gish，W.，Altschul，S.F.1991.″Improved Sensitivity of Nucleic Acid Database Search Using Application-Specific Scoring Matrices″(使用特异性应用计分矩阵的核酸数据库搜索灵敏度的 提高)Methods：A companion to Methods in Enzymology 3(1)：66-77.
103.Steven Henikoff和G.Henikoff.1992″Amino acid substitution matrices from protein blocks.″(来自蛋白组分的氨基酸替换矩阵)Proc. Natl.Acad.Sci.USA.89(生物化学)：10915-10919.
104.Steven Henikoff和G.Henikoff.″Performance Evaluation of Amino Acid Substitution Matrices.″(氨基酸替换矩阵的效果评估) Proteins：Structure，Function，and Genetics.17：49-61.
105.Sui G等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：5515-5520.
106.Vallance，B.A.，W.Deng，L.A.和B.B.Finlay.2002.Mice lacking T and B lymphocytes develop transient colitis and crypt hyperplasia yet suffer impaired bacterial clearance during Citrobacter rodentium infection(缺乏T 和B淋巴细胞的小鼠在Citrobacter rodentium感染过程中发展了临时的大 肠炎和腺腔增生但却遭受了削弱的细菌清除).Infect Immun 70：2070-81.
107.Van Donkersgoed等人，Can.Vet.J.(1999)40：332.
108.Van Donkersgoed等人，Can.Vet.J.(2001)42：714.
109.Yu J-Y等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：6047-6052.
110.Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子 克隆：实验室手册)，第2版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，冷 泉港，N.Y.，1989.
111.Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物 学现代技术)，John Wiley & Sons，1994.
112.Vaughan等人，Nature Biotech 14：309-314，1996.
113.Larsson A等人，Chicken antibodies：taking advantage of evolution--a review鸡(抗体：对进化的利用-综述).Poult Sci.1993十月； 72(10)：1807-12.
114.Alymova IV，Kodihalli S，Govorkova EA，Fanget B，Gerdil C， Webster RG.Immunogenicity and protective efficacy in mice of influenza B virus vaccines grown in mammalian cells or embryonated chicken eggs(生长 于哺乳动物细胞或胚胎期鸡蛋中的乙型流感病毒疫苗在小鼠中的免疫原 性和保护性功效).J Virol.1998五月；72(5)：4472-7.
115.O′Farrelly C，Branton D，Wanke CA.Oral ingestion of egg yolk immunoglobulin from hens immunized with an enterotoxigenic Escherichia coli strain prevents diarrhea in rabbits challenged with the same strain(口服 灌注用肠毒性大肠杆菌菌株免疫的母鸡的蛋黄免疫球蛋白能够预防用相 同菌株感染兔子引起的腹泻).Infect Immun.1992，七月；60(7)：2593-7.
116.Romito M，Viljoen GJ，Du Plessis DH.Eliciting antigen-specific egg-yolk IgY with naked DNA(用裸DNA诱发抗原特异性的蛋黄IgY). Biotechniques.2001，九月；31(3)：670，672，674-5.
117.Yokoyama H，Umeda K，Peralta RC，Hashi T，Icatlo FC Jr，Kuroki M，Ikemori Y，Kodama Y.Oral passive immunization against experimental salmonellosis in mice using chicken egg yolk antibodies specific for Salmonella enteritidis and S.typhimurium(使用肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙 门氏菌特异的鸡蛋黄抗体在小鼠中进行针对实验性沙门氏菌感染的口服 被动免疫).Vaccine.1998，二月；16(4)：388-93.
其他实施方案
尽管在此已公开了本发明的多种实施方案，但本领域所属技术人员 仍可根据常用一般知识在本发明范围内进行多种改变和修改。这些修改 包括用基本上相同的方法为达到本发明相同结果的本发明任意方面的公 知等价替换。正如在此使用的登录号，涉及多种数据库的登录号，包括 GenBank、欧洲分子生物学实验室(EMBL)、日本的DNA数据库(DDBJ)、 或核苷酸序列的基因组序列数据中心(GSDB)，还包括蛋白信息资源 (PIR)、SWISSPROT、蛋白研究基金会(PRF)、蛋白数据库(PDB)(来自解 析结构的序列)，以及针对多肽序列，来自于GenBank、EMBL、DDBJ 或RefSeq核苷酸序列编码区注释的翻译物。所使用的数字范围包括了定 义该范围的数字。在本说明书中，“包括”一词是开放性的术语，基本相 当于短语“包括但不限于”，“包含”一词也具有对应的词义。在此引用 的参考文献也并不应该理解为本发明的现有技术。所有在此引用的出版 物就如每一种单独出版物都被特异性和单独地指明被作为参考在此引入 一样，且就如本文全部给出那样。本发明包括了所有实施方案及其如前 所描述的变化，以及对实施例和附图的参考。
                             序列表
<110>不列颠哥伦比亚大学等
<120>细菌毒力因子及其用途
<130>80021-735
<140>未转让
<141>2004-10-29
<150>US 60/515,703
<151>2003-10-31
<160>84
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1293
<212>DNA
<213>Citrobacter rodentium
<400>1
atgaacattc aaccgaacat acattccgga atcaccacac agaataatca acaacatcat     60
cacgcagaac aagtgcctgt ctctagctca ataccgcgat cagatttacc tccaaattgc    120
gaagctggat ttgttgtgca tattccagag gatatacagc aacatgtacc ggaatgtggt    180
gaaacaacgg ctctattaag cttgataaaa gatgaaggcc tgctctcagg actagataaa    240
tatcttgctc ctcaccttga agaaggctcc cttgggaaaa aagcattgga tacgtttggt    300
ttattcaatg ttactcaaat ggcattagag atacccagtt ccgttccagg catatctggt    360
aaatatggtg ttcagatgaa cattgtaaaa ccagacatac atccaacaac cgggaactat    420
tttttacagc tatttcctct gcatgacgaa ataggtttta acttcaaaga tcttcctggc    480
ccattaaaaa atgcattaac caacagcagt atatcggcta ctgcatcgac tgtagccccc    540
acaccaaacg acccaatgcc atggtttgga ttaactgctc aagtggttcg taatcatggt    600
gtagaacttc ctatagtcaa aaccgaaaat ggatggaagc ttgtagggga aacacctctt    660
actccagatg gccccaaagc caattatacg gaagaatggg ttatcaggcc gggagaagca    720
gattttaaat atggaacatc gccattacag gcaactcttg gactggagtt tggtgcgcat    780
tttaagtggg atttagataa tcctaatacc aaatatgcca tccttaccaa tgctgccgca    840
aatgctattg gtgctgctgg agggtttgcg gtatccaaag tccccggcat agatccaatg    900
ctgtcccctc atgtcggtgc aatgcttggg caagcagcgg ggcatgccgt acaatgtaat    960
acccccggat taaagccaga cactatttta tggtgggcag gcgcgacatt tggagctgct   1020
gatttaaata aagccgaatt tgataaagtg cggttcactg actaccctcg tatatggttc   1080
catgcacggg aaggagcttt attcccaaat aagcaagaca ttgcccgtgt aacaggcgca   1140
gacataaaag ctatggaaga aggcgtaccc gttggacatc aacatccaaa accggaggat   1200
gtggtcatcg atatcgaagg tggcaattca ccacatcata atccatcaaa ttatgttgac   1260
acctttgaaa taatccaaga aacaagggtc taa                                1293
<210>2
<211>1323
<212>DNA
<213>Enteropathogenic E.coli
<400>2
atgaacattc aaccgatcgt aacatccgga atcaccacac aaaacaatcg acatcatcac     60
gcagaacaaa cgtcccctac acaaataccg caatccgaat tacctaatgg atgcgaaacg    120
ggatttgttg ttcatatccc agaggatatg cagcgacatg caccggaatg cggtgaaaca    180
acagctctac tgagcttgat aaaagatgaa ggtctgctct ctgggctgga taaatatctt    240
gcacctcatc ttgaagaagg ctctgcagga aaaaaagcat tggatatgtt tggtttattc    300
aatgtctctc agatggcatt agaaataccc agcaccgttc cgggtatctc tggtaaatat    360
ggtgtccagc taaacattgt aaaaccagat attcatccta catcaggtaa ttatttttta    420
cagatattcc ctttgcatga tgaaataggt attaatttta aagaccttcc tggtccatta    480
aaaaatgcat taagcaacag caatatacca accactgtat cgactgctgc atccactatt    540
gcatcagcca ctacttcgac ggtaaccacc gcgtcaaaag acccaatacc atggtttgga    600
ttaacagctc aagtagttcg taatcatggt gtggaacttc ctatagtcaa aactgaaaat    660
ggatggaagc ttgttggaga aactcctctt actcctgatg gccccaaagc aaattatact    720
gaagagtggg tgatcagacc gggagaagca gattttaaat atggtgcatc tccactacag    780
gcaactctag ggctggagtt tggcgcacat ttcaagtggg atttagataa ccctaatact    840
aaatatgccg ttcttaccaa tgctgccgca aatgcgcttg gtgctgtagg gggatttgca    900
gtatccagat ttactggtac agatccaatg ttaagtcctc atatcggtgc aatggttggg    960
caagcagcgg ggcatgccat acagtataat acccccggat taaagccaga cactatttta   1020
tggtgggcag gtactactct tggactggct gatttaaaca aggccgagtt tggagaggcc   1080
agattcactg actatcctcg tatatggtgg catgcaagag aaggtgccat tttcccaaat   1140
aaagcagata ttgaacatgc cacaggggct gatatacgcg caatggaaga aggtgtatct   1200
gttggacaac ggcatccaaa tccagaggat gtggtcatca atatcgaaag caataactca   1260
ccacatcata acccatcaaa ttatgttgat accgttgata taatccaaga aacaagagtc   1320
taa                                                                 1323
<210>3
<211>1326
<212>DNA
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>3
atgaacattc aaccgaccat acaatctgga atcacctcac aaaacaatca acatcatcaa     60
acagaacaaa taccctctac acaaataccg caatccgaat tacctctagg atgccaagct    120
ggatttgttg ttaatattcc agatgatata cagcaacatg caccggaatg cggtgaaaca    180
acagctctac tgagcttgat aaaagataaa ggtctgctct cagggctaga cgaatatata    240
gctcctcacc ttgaagaagg atccatagga aaaaaaacat tggatatgtt tggtttattc    300
aatgttaccc aaatggcatt agagatacct agttccgttt caggcatctc tggtaaatat    360
ggtgtccagc taaacattgt aaaaccagat attcatccta catcaggtaa ttatttttta    420
cagatattcc ctctgcatga tgaaataggt tttaatttta aagaccttcc tggcccgtta    480
aaaaatgcat taagcaacag taatatatca accactgcag tgtcgactat tgcatcgact    540
ggaacatcag ccactacttc gacggtaacc accgagccaa aagacccaat accatggttt    600
ggattaacag ctcaagtggt tcgtaatcat ggtgtagaac ttcctatagt caaaactgaa    660
aatggatgga agcttgttgg agaaacacca cttactcctg atgggccgaa agcaaattac    720
acggaggagt gggttatcag accgggagaa gcagatttta aatatggtgc atctccatta    780
caggcaactc tagggctgga gtttggcgca catttcaagt gggatttaga taaccctaat    840
actaaatatg ccgttcttac caatgctgcc gcaaatgcgc ttggtgcttt agggggattt    900
gcagtatcca gatttgctag tacagatcca atgttaagtc ctcatatcgg tgcaatggtt    960
gggcaagcag cagggcatgc catacagtat aatacccctg gattaaagcc agacactatt   1020
ttatggtggg ctggtgcgac actgggggct gccgatttaa acaaggccga gtttgaagta   1080
gctagattca ctgactatcc tcgtatatgg tggcacgcaa gagaaggagc tattttcccc   1140
aataaagcag atattgaaca tgccacaggt gctgatatac gcgcaatgga agaaggtatc   1200
cctgttggac agcggcatcc aaatccagag gatgtggtaa tcgatatcga aagcaatggc   1260
ttaccacatc ataatccatc aaatcatgtt gatatctttg atataatcca agaaacaaga   1320
gtctaa                                                              1326
<210>4
<211>614
<212>DNA
<213>Citrobacter rodentium
<400>4
tattcttttt cagtggtttg aagcaaggcc agagcgatac ggaaaaggtg aagtaccgat     60
attgaatacc aaagagcatc cgtatttgag caatattata aatgctgcaa aaatagaaaa    120
tgagcgcgta ataggagtac tggtagacgg agactttact tatgagcaaa gaaaagaatt    180
tctcagtctt gaagatgaac atcaaaatat aaagataata tatcgggaaa atgttgattt    240
cagtatgtat gataaaaaac tgtctgatat ttatcttgaa aatattcatg aacaagaatc    300
atatccagcg agtgagagag ataattatct gttaggctta ttaagagaag agttaaaaaa    360
tattccatac ggaaaggact ctttgattga atcatatgca gaaaaaagag gtcatacttg    420
gtttgatttt tttagaaact tggcggtatt gaaggggggg gggttgttta cagagacggg    480
taaaactgga tgccataaca tatctccatg tgggggatgt atatatcttg atgcagatat    540
gattattact gataaattag gtgtcctgta tgctcctgat ggtatcgctg tgcatgtaga    600
ttgtaatgat gaga                                                      614
<210>5
<211>555
<212>DNA
<213>Citrobacter rodentium
<400>5
aaggccagag cgatacggaa aaggtgaagt accgatattg aataccaaag agcatccgta     60
tttgagcaat attataaatg ctgcaaaaat agaaaatgag cgtaatggag tactggtaga    120
cggagacttt acttatgagc aaagaaaaga atttctcagt cttgaagatg aacatcaaaa    180
tataaagata atatatcggg aaaatgttga tttcagtatg tatgataaaa aactgtctga    240
tatttatctt gaaaatattc atgaacaaga atcatatcca gcgagtgaga gagataatta    300
tctgttggtt ttaagagaag agttaaaaaa tattccatac ggaaaggact ctttgattga    360
atcatatgca gaaaaaagag gtcatacttg gtttgatttt tttagaaact tggcggtatt    420
gaaggggggg gggttgttta cagagacggg taaaactgga tgccataaca tatctccatg    480
tgggggatgt atatatcttg atgcagatat gattattact gataaattag gtgtcctgta    540
tgctcctgat ggtat                                                     555
<210>6
<211>990
<212>DNA
<213>Enteropathogenic E.coli
<400>6
atgttatctt cattaaatgt ccttcaatcc agcttcagag gaaagacagc tttatcaaat     60
agtacacttc tccagaaagt ttcttttgct ggaaaagaat attctctgga acctattgat    120
gaaagaaccc ctattctttt tcagtggttt gaagcaaggc cagagcgata cgaaaaagga    180
gaagtaccaa tattgaatac caaagaacat ccgtatttga gcaatattat aaatgctgca    240
aaaatagaaa atgagcgtat aatcggtgtg ctggtagatg gaaattttac ttatgaacaa    300
aaaaaggaat ttctcaatct tgaaaatgaa catcaaaata taaaaataat ctaccgagca    360
gatgtggatt tcagcatgta tgataaaaaa ctatctgata tttaccttga aaatatccat    420
aaacaagaat cataccctgc cagtgagagg gataattatc tgttaggctt attaagagaa    480
gagttaaaaa atatcccaga aggtaaggac tctttgattg agtcatatgc agaaaaaaga    540
gaacatactt ggtttgattt tttcaggaat ttggccatat tgaaggctgg aagtttgttt    600
acagagacgg gaaaaactgg atgccataac atatcgccct gtagcggatg tatatatctt    660
gatgccgaca tgattattac cgataaatta ggagtcctgt atgctcctga tggtatcgct    720
gtgcatgtag attgtaatga tgagataaaa agtcttgaaa atggtgcgat agttgtcaat    780
cgtagtaatc atccagcatt acttgcaggc ctcgatatta tgaagagtaa agttgacgct    840
catccatatt atgatggtct aggaaagggt atcaagcggc attttaacta ttcatcgtta    900
cacaattata atgctttttg tgattttatt gaatttaagc atgaaaatat tataccgaat    960
accagtatgt ataccagcag ttcatggtaa                                     990
<210>7
<211>990
<212>DNA
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>7
atgttatctt cattaaatgt ccttcaatcc agcttcagag gaaagacagc tttatcaaat     60
agtacacttc tccagaaagt ttcttttgct ggaaaagaat atcctctgga acctattgat    120
gaaaaaaccc ctattctttt tcagtggttt gaagcaaggc cagagcgata cgaaaaagga    180
gaagtaccaa tattgaatac caaagaacat ccgtatttga gcaatattat aaatgctgca    240
aaaatagaaa atgagcgtat aatcggtgtg ctggtagatg gaaattttac ttatgaacaa    300
aaaaaggaat ttctcagtct tgaaaatgaa tatcaaaata taaaaataat ctaccgagca    360
gatgtggatt tcagcatgta tgataaaaaa ctatctgata tttaccttga aaatatccat    420
aaacaagaat cataccctgc cagtgagagg gataattatc tgttaggctt attaagagaa    480
gagttaaaaa atatcccaga aggtaaggac tctttgattg agtcatatgc agaaaaaaga    540
gaacatactt ggtttgattt tttcaggaat ttggccatgt tgaaggctgg aagtttgttt    600
acagagacgg gaaaaactgg atgccataac atatcgccct gtagcggatg tatatatctt    660
gatgccgaca tgattattac cgataaatta ggagtcctgt atgctcctga tggtatcgct    720
gtgcatgtag attgtaatga tgagataaaa agtcttgaaa atggtgcgat agttgtcaat    780
cgtagtaatc atccagcatt acttgcaggc ctcgatatta tgaagagtaa agttgacgct    840
catccatatt atgatggtct aggaaagggt atcaagcggc attttaacta ttcatcgtta    900
cacgattata atgctttttg tgattttatt gaatttaagc atgaaaatat tataccgaat    960
accagtatgt atacctgcag ttcatggtaa                                     990
<210>8
<211>993
<212>DNA
<213>Citrobacter rodentium
<400>8
atgaaaattc cctcactcca gcccagcttc aactttttcg ccccagcagg atactctgct     60
gccgttgctc ccaatcgttc ggacaatgcc tatgctgatt acgtattgga tataggcaag    120
cgaataccac tttccgcgga agatttaggc aacctatatg aaaatgtcat tcgcgccgtt    180
cgtgacagcc gtagcaagct catagatcag catacggtcg atatgattgg taacactata    240
cttgatgctt tgagccgatc acaaaccttt cgtgatgccg taagctatgg cattcataat    300
aaggaggtac acattggttg cattaaatac agaaacgaat acgagctcaa cggagaatcc    360
cccgtcaaag ttgatgatat tcaatcacta acctgtaccg aattatatga atacgatgtc    420
gggcaagaac caattttacc catttgcgag gcaggagaaa acgataacga agagccttat    480
gtcagtttta gtgttgcgcc agatactgac tcttatgaga tgccatcgtg gcaggaaggg    540
ctgattcacg agattattca tcatgtgact ggagctagcg atccgtctgg agatagtaat    600
atagagctag gacccacgga gattctcgca cgtcgtgtcg ctcaagagct gggatggact    660
gtccccgact tcataggata tgcagagcca gatcgtgaag ctcatcttag gggacgtaac    720
ctgaatgccc ttcgacaggc ggccatgcga catgaagata atgagaggac tttcttcgaa    780
aggctgggta tgatcagtga tcgatatgag gcgagtcctg atttcacaga gtattccgct    840
gtgtctaaca tagaatatgg atttatccag caacatgatt ttcccgggtt ggctatcgac    900
gataatttac aggatgcaaa tcagatccaa ctctatcatg gagcacctta tatctttaca    960
ttcggggatg tggacaaaca caatcagcgc tga                                 993
<210>9
<211>993
<212>DNA
<213>Enteropathogenic E.coli
<400>9
atgaaaattc cctcattaca gtccaacttc aacttttccg ccccggcagg atactctgct     60
cccattgctc ctaatcgtgc tgaaaatgcc tatgcggatt acgttttgga tataggtaag    120
cgaataccac tttccgcagc agatttaagc aacgtatacg aaagtgtaat acgcgccgtc    180
catgacagcc gtagcaggct tatcgatcag catacagtcg atatgatcgg caacactgta    240
cttgatgctt tgagccgatc acagacattt cgtgatgccg taagctatgg cattcataat    300
gagaaggtac acattggttg cattaaatac agaaacgaat acgagcttaa cgaagaatct    360
tctgtcaaaa ttgatgatat tcaatcacta acctgtaacg aattatatga atatgatgtc    420
gggcaagagc caattttccc catttgcgaa gcaggagaaa acgataacga agagccttat    480
gtcagtttta gtgttgcgcc agatactgac tcttatgaga tgccatcgtg gcaggaagga    540
ctgattcacg agattattca tcatgttact ggatctagcg atccatctgg agatagtaat    600
atagagttag gacccaccga gattctcgca cgtcgtgtcg ctcaagaact gggatggagt    660
gttcccgact tcaaaggata tgcagagcca gaacgtgaag ctcatcttag gttacgtaac    720
ctgaatgccc ttcgacaggc tgccatgagg catgaagaga atgagagggc tttcttcgaa    780
aggctgggta cgatcagtga ccgatatgag gcgagtcctg atttcacaga gtattccgct    840
gtgtctaaca taggatacgg atttatccag caacatgatt ttcctggatt ggctatcaac    900
gataatttac aggatgcaaa tcagatccaa ctgtatcatg gcgcccctta tatttttaca    960
tttggggatg tggacaaaca caatcagcga tga                                 993
<210>10
<211>993
<212>DNA
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>10
atgaaaattc cctcattaca gtccaacttc aacttttccg ccccggcagg atactctgct     60
cccattgctc ctaatcgtgc tgaaaatgcc tatgcggatt acgttttgga tataggtaag    120
cgaataccac tttccgcagc agatttaagc aacgtatacg aaagtgtaat acgcgccgtc    180
catgacagcc gtagcaggct tatcgatcag catacagtcg atatgatcgg caacactgta    240
cttgatgctt tgagccgatc acagacattt cgtgatgccg taagctatgg cattcataat    300
gagaaggtac acattggttg cattaaatac agaaacgaat acgagcttaa cgaagaatct    360
tctgtcaaaa ttgatgatat tcaatcacta acctgtaacg aattatatga atatgatgtc    420
gggcaagagc caattttccc catttgcgaa gcaggagaaa acgataacga agagccttat    480
gtcagtttta gtgttgcgcc agatactgac tcttatgaga tgccatcgtg gcaggaagga    540
ctgattcacg agattattca tcatgttact ggatctagcg atccatctgg agatagtaat    600
atagagttag gacccaccga gattctcgca cgtcgtgtcg ctcaagaact gggatggagt    660
gttcccgact tcaaaggata tgcagagcca gaacgtgaag ctcatcttag gctacgtaac    720
ctgaatgccc ttcgacaggc tgccatgagg catgaagaga atgagagggc tttcttcgaa    780
aggctgggta cgatcagtga ccgatatgag gcgagtcctg atttcacaga gtattccgct    840
gtgtctaaca taggatacgg atttatccag caacatgatt ttcctggatt ggctatcaac    900
gataatttac aggatgcaaa tcagatccaa ctgtatcatg gcgcccctta tatttttaca    960
tttggggatg tggacaaaca caatcagcaa tga                                 993
<210>11
<211>708
<212>DNA
<213>Citrobacter rodentium
<400>11
atgcgcccta catcccttaa cctgacatta ccttcgttac ctctaccctc atcttcaaat     60
tcaatttcag ccacagacat tcaatctctt gtaaaaatgt cgggtgtgcg ctgggtgaaa    120
aacaaccaac aactctgttt ccacgggact gaccttaaaa tctaccagca tcttgaagct    180
gccctcgata agatcgaatc cacagacact ggacgtactc ttttgaactg tattgaatta    240
acatcccgac tcaaatcaga aaaactggca atacatctcg attctgctga gttaggggtg    300
atagcacact gcaatgcgga tgctgaaaac tcccgaggaa ctggctccga ctttcactgt    360
aatctgaatg cagttgaata tccctgcggg caaggaatta gcctggtaga ctttcatgca    420
tgcattgttt tccatgaact tctccacgtt ttccacaatt taaatggaga gcgcctgaaa    480
gttgagagtt ctcaaccaga attacaaaca cactccccac ttttactcga agaagccagg    540
actgttgggt tgggtgcttt ttctgaagaa gttctttcag aaaataaatt tcgtgaagag    600
attgggatgc cccgcagaac attctacccg cacgattcat ctctcattca tgatgacaat    660
acagtgactc agagattcca gcggaaaaaa ctgcatccgt tactttag                 708
<210>12
<211>699
<212>DNA
<213>Enteropathogenic E.coli
<400>12
atgcgcccta cgtccctcaa cttggtatta catcagtcat caacgtcgag ctcaatgtca     60
gatacagata tcgagtctct tgtaaaagca tcgagcgttc aatggataaa aaataatccg    120
caacttcgtt tccaggggac tgatcataat atatatcagc agattgaagc agcactcgat    180
aagattggct ctacagagac agggcgtgta ctcctgaatg ctattgaatc aatatcccga    240
cttaaatcag aaacagtggt aatacacctc aactcttcca gactaggagt tatggcacat    300
agagatatag atgctgagaa ccatcggggg actggttccg attttcactg taatctgaat    360
gcagttgaat atccctgtgg ggaggggatt agcgtggtgg actttcatgc gactattgtt    420
tttcatgagt tgctccatgt tttccacaat ttaaatgggg agcgtttgaa agttgagagt    480
tcccgaccag aatcacaaaa atactctcca cttttactcg aagaagccag gactgttggg    540
ttgggggctt tttcagagga ggtgctttca gaaaataaat tccgcgaaga gattgggatg    600
ccccgtagaa cctcctaccc gcacgactca gctcttattc atgatgacaa tacagtgagt    660
ctgggattcc aacaggtaag actgcatcca ttgctttag                           699
<210>13
<211>699
<212>DNA
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>13
atgcgcccta cgtccctcaa cttggtatta catcagtcat caaggtcgag ctcaatgtca     60
gatacagata tcgagtctct tgtaaaagca tcgagcgttc aatggataaa aaataatccg    120
caacttcgtt tccaggggac tgatcataat atatatcagc agattgaagc agcactcgat    180
aagattggct ctacagagac agggcgtgta ctcctgaatg ctattgaatc aatatcccga    240
cttaaatcag aaacagtggt aatacacctc aactcttcca gactaggagt tatggcacat    300
agagatatag atgctgagaa ccatcggggg actggttccg attttcactg taatctgaat    360
gcagttgaat atccctgtgg ggaggggatt agcgtggtgg actttcatgc gactattgtt    420
tttcatgagt tgctccatgt tttccacaat ttaaatgggg agcgtttgaa agttgagagt    480
tcccgagcag aatcacaaaa atactctcca cttttactcg aagaagccag gactgttggg    540
ttgggggctt tttcagagga ggtgctttca gaaaataaat tccacgaaga gattgggatg    600
ccccgtagaa cctcctaccc gcrcgactca gctcttattc atgatgacaa tacagtgagt    660
ctgggattcc aacaggtaag actgcatcca ttgctttag                           699
<210>14
<211>506
<212>DNA
<213>Citrobacter rodentium
<400>14
tactttaatg aatcacccaa tgtatatgat aagaagtata tatctggcgt aactagagga     60
gtagctgaac taaaacagga aggatttatt aacgagaaag ccaggcgact tgcttatatg    120
caagcaatgt attctgtatg tccggaagag tttaaaccta tttccagaaa cgaagctagt    180
acaccggaag gcagctggct aacagttata tccggaaaac gcccaatggg acagttttct    240
gtagatagct tatatcatcc tgacttacat gcattgtgtg agcttccgga tatttgttgc    300
aagatcttcc ctaaagaaaa caatgatttt ttgtatatag tgattgtgta cagaaatgac    360
agccctctgg gagaacaacg agcaaatcga tttatagaat tatataatat aaaaagagac    420
atcatgcagg aattaaatta tgaatctcca gagttaaagg ctgtgaaatc tgaaatgatt    480
attgcacgtg aaatgggaga aatctt                                         506
<210>15
<211>466
<212>DNA
<213>Citrobacter rodentium
<400>15
caatgtatat gataagaagt atatatctgg cgtaactaga ggagtagctg aactaaaaca     60
ggaaggattt attaacgaga aagccaggcg acttgcttat atgcaagcaa tgtattctgt    120
atgtccggaa gagtttaaac ctatttccag aaacgaagct agtacaccgg aaggcagctg    180
gctaacagtt atatccggaa aacgcccaat gggacagttt tctgtagata gcttatatca    240
tcctgactta catgcattgt gtgagcttcc ggatatttgt tgcaagatct tccctaaaga    300
aaacaatgat tttttgtata tagtgattgt gtacagaaat gacagccctc tgggagaaca    360
acgagcaaat cgatttatag aattatataa tataaaaaga gacatcatgc aggaattaaa    420
ttatgaatct ccagagttaa aggctgtgaa atctgaaatg attatt                   466
<210>16
<211>675
<212>DNA
<213>Enteropathogenic E.coli
<400>16
atgattaatc ctgttactaa tactcagggc gtgtccccta taaatactaa atatgctgaa     60
catgtggtga aaaatattta cccgaaaatt aaacatgatt actttaatga atcacccaat    120
atatatgata agaagtatat atccggtata accagaggag tagctgaact aaaacaggaa    180
gaatttgtta acgagaaagc cagacggttt tcttatatga agactatgta ttctgtatgt    240
ccagaagcgt ttgaacctat ttccagaaat gaagccagta caccggaagg aagctggcta    300
acagttatat ccggaaaacg cccaatgggg cagttttctg tagatagttt atacaatcct    360
gatttacatg cattatgtga gcttccggac atttgttgta agatcttccc taaagaaaat    420
aatgattttt tatacatagt tgttgtgtac agaaatgaca gccctctagg agaacaacgg    480
gcaaatagat ttatagaatt atataatata aaaagagata tcatgcagga attaaattat    540
gagttaccag agttaaaggc agtaaaatct gaaatgatta tcgcacgtga aatgggagaa    600
atctttagct acatgcctgg ggaaatagac agttatatga aatacataaa taataaactt    660
tctaaaattg agtag                                                     675
<210>17
<211>675
<212>DNA
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>17
atgattaatc ctgttactaa tactcagggc gtgtccccta taaatactaa atatgctgaa     60
catgtggtga aaaatattta cccggaaatt aaacatgatt actttaatga atcacccaat    120
atatatgata agaagtatat atccggtata accagaggag tagctgaact aaaacaggaa    180
gaatttgtta acgagaaagc cagacggttt tcttatatga agactatgta ttctgtatgt    240
ccagaagcgt ttgaacctat ttccagaaat gaagccagta caccggaagg aagctggcta    300
acagttatat ccggaaaacg cccaatgggg cagttttctg tagatagttt atacaatcct    360
gatttacatg cattatgtga gcttccggac atttgttgta agatcttccc taaagaaaat    420
aatgattttt tatacatagt tgttgtgtac agaaatgaca gccctctagg agaacaacgg    480
gcaaatagat ttatagaatt atataatata aaaagagata tcatgcagga attaaattat    540
gagttaccag agttaaaggc agtaaaatct gaaatgatta tcgcacgtga aatgggagaa    600
atctttagct acatgcctgg ggaaatagac agttatatga aatacataaa taataaactt    660
tctaaaattg agtag                                                     675
<210>18
<211>570
<212>DNA
<213>Citrobacter rodentium
<400>18
atgttaccaa caagtggttc ttcagcaaat ctttactcat ggatgtatat ctcaggaaaa     60
gagaatcctt cgactccgga atcagtaagt gaacttaatc ataatcattt tctttctcct    120
gaattacagg agaaactgga tgttatgttc gccatatatt catgtgccag aaacaatgat    180
gagcgtgaga atatttaccc ggagctaagg gattttgtaa gtagcctaat ggataagaga    240
aacaatgtgt ttgaggtgat aaatgaagat actgatgagg tgaccggagc tctgagagcg    300
ggaatgacga tagaggacag ggatagttat atcagggatc ttttttttct gcattcattg    360
aaagtaaaaa ttgaggaaag cagacaagat aaagaggatt ggaaatgtaa agtttatgat    420
ctgctatgtc cgcatcattc ttcagagcta tatggggatc tacgggcaat caaatgcctc    480
gttgaaggat gcagtgatga ttttagtcct tttgatacta ttaaggtgcc ggatcttact    540
tacaacaaag gatctttaca atgtggatga                                     570
<210>19
<211>519
<212>DNA
<213>Citrobacter rodentium
<400>19
agcaaatctt tactcatgga tgtatatctc aggaaaagag aatccttcga ctccggaatc     60
agtaagtgaa cttaatcata atcattttct ttctcctgaa ttacaggaga aactggatgt    120
tatgttcgcc atatattcat gtgccagaaa caatgatgag cgtgagaata tttacccgga    180
gctaagggat tttgtaagta gcctaatgga taagagaaac aatgtgtttg aggtgataaa    240
tgaagatact gatgaggtga ccggagctct gagagcggga atgacgatag aggacaggga    300
tagttatatc agggatcttt tttttctgca ttcattgaaa gtaaaaattg aggaaagcag    360
acaagataaa gaggattgga aatgtaaagt ttatgatctg ctatgtccgc atcattcttc    420
agagctatat ggggatctac gggcaatcaa atgcctcgtt gaaggatgca gtgatgattt    480
tagtcctttt gatactatta aggtgccgga tcttactta                           519
<210>20
<211>570
<212>DNA
<213>Enteropathogenic E.coli
<400>20
atgttaccaa caagtggttc ttcagcaaat ctttattcat ggatgtatgt atcaggaaga     60
ggtaaccctt cgactccgga atcagtaagt gagcttaatc ataatcactt tctttctcct    120
gaattacaag ataaacttga tgttatggtc tctatatatt catgtgccag aaataataat    180
gagcttgagg aaatttttca agagctaagt gcttttgtaa gtgggctgat ggataagaga    240
aatagtgtat ttgaggtgag aaatgaaaat actgatgagg ttgtcggagc gctgagggcg    300
ggaatgacga tagaggatag ggatagttat atcagggatc ttttttttct gcattcattg    360
aaagtaaaaa ttgaggaaag tagacaaggc aaagaagatt cgaaatgtaa agtttataat    420
ctgctatgtc cgcatcactc ttcagagcta tatggtgatc tacgagcaat gaaatgcctc    480
gtggaaggat gcagtgatga ttttaatcct tttgatatta ttagggtacc agatcttact    540
tacaacaaag gatctttaca atgtggatga                                     570
<210>21
<211>570
<212>DNA
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>21
atgttaccaa caagtggttc ttcagcaaat ctttattcat ggatgtatgt atcaggaaga     60
ggtaaccctt cgactccgga atcagtaagt gagcttaatc ataatcactt tctttctcct    120
gaattacaag ataaacttga tgttatggtc tctatatatt catgtgccag aaataataat    180
gagcttgagg aaatttttca agagctaagt gcttttgtaa gtgggctgat ggataagaga    240
aatagtgtat ttgaggtgag aaatgaaaat actgatgagg ttgtcggagc gctgagggcg    300
ggaatgacga tagaggacag ggatagttat atcagggatc ttttttttct gcattcattg    360
aaagtaaaaa ttgaggaaag tagacaaggc aaagaagatt cgaaatgtaa agtttataat    420
ctgctatgtc cgcatcactc ttcagagcta tatggtgatc tacgagcaat gaaatgcctc    480
gtggaaggat gcagtgatga ttttaatcct tttgatatta ttagggtacc agatcttact    540
tacaacaaag gatctttaca atgtggatga                                     570
<210>22
<211>430
<212>PRT
<213>Citrobacter rodentium
<400>22
Met Asn Ile Gln Pro Asn Ile His Ser Gly Ile Thr Thr Gln Asn Asn
1               5                   10                  15
Gln Gln His His His Ala Glu Gln Val Pro Val Ser Ser Ser Ile Pro
            20                  25                  30
Arg Ser Asp Leu Pro Pro Asn Cys Glu Ala Gly Phe Val Val His Ile
        35                  40                  45
Pro Glu Asp Ile Gln Gln His Val Pro Glu Cys Gly Glu Thr Thr Ala
    50                  55                  60
Leu Leu Ser Leu Ile Lys Asp Glu Gly Leu Leu Ser Gly Leu Asp Lys
65                  70                  75                  80
Tyr Leu Ala Pro His Leu Glu Glu Gly Ser Leu Gly Lys Lys Ala Leu
                85                  90                  95
Asp Thr Phe Gly Leu Phe Asn Val Thr Gln Met Ala Leu Glu Ile Pro
            100                 105                 110
Ser Ser Val Pro Gly Ile Ser Gly Lys Tyr Gly Val Gln Met Asn Ile
        115                 120                 125
Val Lys Pro Asp Ile His Pro Thr Thr Gly Asn Tyr Phe Leu Gln Leu
    130                 135                 140
Phe Pro Leu His Asp Glu Ile Gly Phe Asn Phe Lys Asp Leu Pro Gly
145                 150                 155                 160
Pro Leu Lys Asn Ala Leu Thr Asn Ser Ser Ile Ser Ala Thr Ala Ser
                165                 170                 175
Thr Val Ala Pro Thr Pro Asn Asp Pro Met Pro Trp Phe Gly Leu Thr
            180                 185                 190
Ala Gln Val Val Arg Asn His Gly Val Glu Leu Pro Ile Val Lys Thr
        195                 200                 205
Glu Asn Gly Trp Lys Leu Val Gly Glu Thr Pro Leu Thr Pro Asp Gly
    210                 215                 220
Pro Lys Ala Asn Tyr Thr Glu Glu Trp Val Ile Arg Pro Gly Glu Ala
225                 230                 235                 240
Asp Phe Lys Tyr Gly Thr Ser Pro Leu Gln Ala Thr Leu Gly Leu Glu
                245                 250                 255
Phe Gly Ala His Phe Lys Trp Asp Leu Asp Asn Pro Asn Thr Lys Tyr
            260                 265                 270
Ala Ile Leu Thr Asn Ala Ala Ala Asn Ala Ile Gly Ala Ala Gly Gly
        275                 280                 285
Phe Ala Val Ser Lys Val Pro Gly Ile Asp Pro Met Leu Ser Pro His
    290                 295                 300
Val Gly Ala Met Leu Gly Gln Ala Ala Gly His Ala Val Gln Cys Asn
305                 310                 315                 320
Thr Pro Gly Leu Lys Pro Asp Thr Ile Leu Trp Trp Ala Gly Ala Thr
                325                 330                 335
Phe Gly Ala Ala Asp Leu Asn Lys Ala Glu Phe Asp Lys Val Arg Phe
            340                 345                 350
Thr Asp Tyr Pro Arg Ile Trp Phe His Ala Arg Glu Gly Ala Leu Phe
        355                 360                 365
Pro Asn Lys Gln Asp Ile Ala Arg Val Thr Gly Ala Asp Ile Lys Ala
    370                 375                 380
Met Glu Glu Gly Val Pro Val Gly His Gln His Pro Lys Pro Glu Asp
385                 390                 395                 400
Val Val Ile Asp Ile Glu Gly Gly Asn Ser Pro His His Asn Pro Ser
                405                 410                 415
Asn Tyr Val Asp Thr Phe Glu Ile Ile Gln Glu Thr Arg Val
            420                 425                 430
<210>23
<211>440
<212>PRT
<213>Enteropathogenic E.coli
<400>23
Met Asn Ile Gln Pro Ile Val Thr Ser Gly Ile Thr Thr Gln Asn Asn
1               5                   10                  15
Arg His His His Ala Glu Gln Thr Ser Pro Thr Gln Ile Pro Gln Ser
            20                  25                  30
Glu Leu Pro Asn Gly Cys Glu Thr Gly Phe Val Val His Ile Pro Glu
        35                  40                  45
Asp Met Gln Arg His Ala Pro Glu Cys Gly Glu Thr Thr Ala Leu Leu
    50                  55                  60
Ser Leu Ile Lys Asp Glu Gly Leu Leu Ser Gly Leu Asp Lys Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Ala Pro His Leu Glu Glu Gly Ser Ala Gly Lys Lys Ala Leu Asp Met
                85                  90                  95
Phe Gly Leu Phe Asn Val Ser Gln Met Ala Leu Glu Ile Pro Ser Thr
            100                 105                 110
Val Pro Gly Ile Ser Gly Lys Tyr Gly Val Gln Leu Asn Ile Val Lys
        115                 120                 125
Pro Asp Ile His Pro Thr Ser Gly Asn Tyr Phe Leu Gln Ile Phe Pro
    130                 135                 140
Leu His Asp Glu Ile Gly Ile Asn Phe Lys Asp Leu Pro Gly Pro Leu
145                 150                 155                 160
Lys Asn Ala Leu Ser Asn Ser Asn Ile Pro Thr Thr Val Ser Thr Ala
                165                 170                 175
Ala Ser Thr Ile Ala Ser Ala Thr Thr Ser Thr Val Thr Thr Ala Ser
            180                 185                 190
Lys Asp Pro Ile Pro Trp Phe Gly Leu Thr Ala Gln Val Val Arg Asn
        195                 200                 205
His Gly Val Glu Leu Pro Ile Val Lys Thr Glu Asn Gly Trp Lys Leu
    210                 215                 220
Val Gly Glu Thr Pro Leu Thr Pro Asp Gly Pro Lys Ala Asn Tyr Thr
225                 230                 235                 240
Glu Glu Trp Val Ile Arg Pro Gly Glu Ala Asp Phe Lys Tyr Gly Ala
                245                 250                 255
Ser Pro Leu Gln Ala Thr Leu Gly Leu Glu Phe Gly Ala His Phe Lys
            260                 265                 270
Trp Asp Leu Asp Asn Pro Asn Thr Lys Tyr Ala Val Leu Thr Asn Ala
        275                 280                 285
Ala Ala Asn Ala Leu Gly Ala Val Gly Gly Phe Ala Val Ser Arg Phe
    290                 295                 300
Thr Gly Thr Asp Pro Met Leu Ser Pro His Ile Gly Ala Met Val Gly
305                 310                 315                 320
Gln Ala Ala Gly His Ala Ile Gln Tyr Asn Thr Pro Gly Leu Lys Pro
                325                 330                 335
Asp Thr Ile Leu Trp Trp Ala Gly Thr Thr Leu Gly Leu Ala Asp Leu
            340                 345                 350
Asn Lys Ala Glu Phe Gly Glu Ala Arg Phe Thr Asp Tyr Pro Arg Ile
        355                 360                 365
Trp Trp His Ala Arg Glu Gly Ala Ile Phe Pro Asn Lys Ala Asp Ile
    370                 375                 380
Glu His Ala Thr Gly Ala Asp Ile Arg Ala Met Glu Glu Gly Val Ser
385                 390                 395                 400
Val Gly Gln Arg His Pro Asn Pro Glu Asp Val Val Ile Asn Ile Glu
                405                 410                 415
Ser Asn Asn Ser Pro His His Asn Pro Ser Asn Tyr Val Asp Thr Val
            420                 425                 430
Asp Ile Ile Gln Glu Thr Arg Val
        435                 440
<210>24
<211>441
<212>PRT
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>24
Met Asn Ile Gln Pro Thr Ile Gln Ser Gly Ile Thr Ser Gln Asn Asn
1               5                   10                  15
Gln His His Gln Thr Glu Gln Ile Pro Ser Thr Gln Ile Pro Gln Ser
            20                  25                  30
Glu Leu Pro Leu Gly Cys Gln Ala Gly Phe Val Val Asn Ile Pro Asp
        35                  40                  45
Asp Ile Gln Gln His Ala Pro Glu Cys Gly Glu Thr Thr Ala Leu Leu
    50                  55                  60
Ser Leu Ile Lys Asp Lys Gly Leu Leu Ser Gly Leu Asp Glu Tyr Ile
65                  70                  75                  80
Ala Pro His Leu Glu Glu Gly Ser Ile Gly Lys Lys Thr Leu Asp Met
                85                  90                  95
Phe Gly Leu Phe Asn Val Thr Gln Met Ala Leu Glu Ile Pro Ser Ser
            100                 105                 110
Val Ser Gly Ile Ser Gly Lys Tyr Gly Val Gln Leu Asn Ile Val Lys
        115                 120                 125
Pro Asp Ile His Pro Thr Ser Gly Asn Tyr Phe Leu Gln Ile Phe Pro
    130                 135                 140
Leu His Asp Glu Ile Gly Phe Asn Phe Lys Asp Leu Pro Gly Pro Leu
145                 150                 155                 160
Lys Asn Ala Leu Ser Asn Ser Asn Ile Ser Thr Thr Ala Val Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Ala Ser Thr Gly Thr Ser Ala Thr Thr Ser Thr Val Thr Thr Glu
            180                 185                 190
Pro Lys Asp Pro Ile Pro Trp Phe Gly Leu Thr Ala Gln Val Val Arg
        195                 200                 205
Asn His Gly Val Glu Leu Pro Ile Val Lys Thr Glu Asn Gly Trp Lys
    210                 215                 220
Leu Val Gly Glu Thr Pro Leu Thr Pro Asp Gly Pro Lys Ala Asn Tyr
225                 230                 235                 240
Thr Glu Glu Trp Val Ile Arg Pro Gly Glu Ala Asp Phe Lys Tyr Gly
                245                 250                 255
Ala Ser Pro Leu Gln Ala Thr Leu Gly Leu Glu Phe Gly Ala His Phe
            260                 265                 270
Lys Trp Asp Leu Asp Asn Pro Asn Thr Lys Tyr Ala Val Leu Thr Asn
        275                 280                 285
Ala Ala Ala Asn Ala Leu Gly Ala Leu Gly Gly Phe Ala Val Ser Arg
    290                 295                 300
Phe Ala Ser Thr Asp Pro Met Leu Ser Pro His Ile Gly Ala Met Val
305                 310                 315                 320
Gly Gln Ala Ala Gly His Ala Ile Gln Tyr Asn Thr Pro Gly Leu Lys
                325                 330                 335
Pro Asp Thr Ile Leu Trp Trp Ala Gly Ala Thr Leu Gly Ala Ala Asp
            340                 345                 350
Leu Asn Lys Ala Glu Phe Glu Val Ala Arg Phe Thr Asp Tyr Pro Arg
        355                 360                 365
Ile Trp Trp His Ala Arg Glu Gly Ala Ile Phe Pro Asn Lys Ala Asp
    370                 375                 380
Ile Glu His Ala Thr Gly Ala Asp Ile Arg Ala Met Glu Glu Gly Ile
385                 390                 395                 400
Pro Val Gly Gln Arg His Pro Asn Pro Glu Asp Val Val Ile Asp Ile
                405                 410                 415
Glu Ser Asn Gly Leu Pro His His Asn Pro Ser Asn His Val Asp Ile
            420                 425                 430
Phe Asp Ile Ile Gln Glu Thr Arg Val
        435                 440
<210>25
<211>204
<212>PRT
<213>Citrobacter rodentium
<400>25
Ile Leu Phe Gln Trp Phe Glu Ala Arg Pro Glu Arg Tyr Gly Lys Gly
1               5                   10                  15
Glu Val Pro Ile Leu Asn Thr Lys Glu His Pro Tyr Leu Ser Asn Ile
            20                  25                  30
Ile Asn Ala Ala Lys Ile Glu Asn Glu Arg Val Ile Gly Val Leu Val
        35                  40                  45
Asp Gly Asp Phe Thr Tyr Glu Gln Arg Lys Glu Phe Leu Ser Leu Glu
    50                  55                  60
Asp Glu His Gln Asn Ile Lys Ile Ile Tyr Arg Glu Asn Val Asp Phe
65                  70                  75                  80
Ser Met Tyr Asp Lys Lys Leu Ser Asp Ile Tyr Leu Glu Asn Ile His
                85                  90                  95
Glu Gln Glu Ser Tyr Pro Ala Ser Glu Arg Asp Asn Tyr Leu Leu Gly
            100                 105                 110
Leu Leu Arg Glu Glu Leu Lys Asn Ile Pro Tyr Gly Lys Asp Ser Leu
        115                 120                 125
Ile Glu Ser Tyr Ala Glu Lys Arg Gly His Thr Trp Phe Asp Phe Phe
    130                 135                 140
Arg Asn Leu Ala Val Leu Lys Gly Gly Gly Leu Phe Thr Glu Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Thr Gly Cys His Asn Ile Ser Pro Cys Gly Gly Cys Ile Tyr Leu
                165                 170                 175
Asp Ala Asp Met Ile Ile Thr Asp Lys Leu Gly Val Leu Tyr Ala Pro
            180                 185                 190
Asp Gly Ile Ala Val His Val Asp Cys Asn Asp Glu
        195                 200
<210>26
<211>186
<212>PRT
<213>Citrobacter rodentium
<400>26
Arg Pro Glu Arg Tyr Gly Lys Gly Glu Val Pro Ile Leu Asn Thr Lys
1               5                   10                  15
Glu His Pro Tyr Leu Ser Asn Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ile Glu Asn
            20                  25                  30
Glu Arg Val Ile Gly Val Leu Val Asp Gly Asp Phe Thr Tyr Glu Gln
        35                  40                  45
Arg Lys Glu Phe Leu Ser Leu Glu Asp Glu His Gln Asn Ile Lys Ile
    50                  55                  60
Ile Tyr Arg Glu Asn Val Asp Phe Ser Met Tyr Asp Lys Lys Leu Ser
65                  70                  75                  80
Asp Ile Tyr Leu Glu Asn Ile His Glu Gln Glu Ser Tyr Pro Ala Ser
                85                  90                  95
Glu Arg Asp Asn Tyr Leu Leu Gly Leu Leu Arg Glu Glu Leu Lys Asn
            100                 105                 110
Ile Pro Tyr Gly Lys Asp Ser Leu Ile Glu Ser Tyr Ala Glu Lys Arg
        115                 120                 125
Gly His Thr Trp Phe Asp Phe Phe Arg Asn Leu Ala Val Leu Lys Gly
    130                 135                 140
Gly Gly Leu Phe Thr Glu Thr Gly Lys Thr Gly Cys His Asn Ile Ser
145                 150                 155                 160
Pro Cys Gly Gly Cys Ile Tyr Leu Asp Ala Asp Met Ile Ile Thr Asp
                165                 170                 175
Lys Leu Gly Val Leu Tyr Ala Pro Asp Gly
            180                 185
<210>27
<211>329
<212>PRT
<213>Enteropathogenic E.coli
<400>27
Met Leu Ser Ser Leu Asn Val Leu Gln Ser Ser Phe Arg Gly Lys Thr
1               5                   10                  15
Ala Leu Ser Asn Ser Thr Leu Leu Gln Lys Val Ser Phe Ala Gly Lys
            20                  25                  30
Glu Tyr Ser Leu Glu Pro Ile Asp Glu Arg Thr Pro Ile Leu Phe Gln
        35                  40                  45
Trp Phe Glu Ala Arg Pro Glu Arg Tyr Glu Lys Gly Glu Val Pro Ile
    50                  55                  60
Leu Asn Thr Lys Glu His Pro Tyr Leu Ser Asn Ile Ile Asn Ala Ala
65                  70                  75                  80
Lys Ile Glu Asn Glu Arg Ile Ile Gly Val Leu Val Asp Gly Asn Phe
                85                  90                  95
Thr Tyr Glu Gln Lys Lys Glu Phe Leu Asn Leu Glu Asn Glu His Gln
            100                 105                 110
Asn Ile Lys Ile Ile Tyr Arg Ala Asp Val Asp Phe Ser Met Tyr Asp
        115                 120                 125
Lys Lys Leu Ser Asp Ile Tyr Leu Glu Asn Ile His Lys Gln Glu Ser
    130                 135                 140
Tyr Pro Ala Ser Glu Arg Asp Asn Tyr Leu Leu Gly Leu Leu Arg Glu
145                 150                 155                 160
Glu Leu Lys Asn Ile Pro Glu Gly Lys Asp Ser Leu Ile Glu Ser Tyr
                165                 170                 175
Ala Glu Lys Arg Glu His Thr Trp Phe Asp Phe Phe Arg Asn Leu Ala
            180                 185                 190
Ile Leu Lys Ala Gly Ser Leu Phe Thr Glu Thr Gly Lys Thr Gly Cys
        195                 200                 205
His Asn Ile Ser Pro Cys Ser Gly Cys Ile Tyr Leu Asp Ala Asp Met
    210                 215                 220
Ile Ile Thr Asp Lys Leu Gly Val Leu Tyr Ala Pro Asp Gly Ile Ala
225                 230                 235                 240
Val His Val Asp Cys Asn Asp Glu Ile Lys Ser Leu Glu Asn Gly Ala
                245                 250                 255
Ile Val Val Asn Arg Ser Asn His Pro Ala Leu Leu Ala Gly Leu Asp
            260                 265                 270
Ile Met Lys Ser Lys Val Asp Ala His Pro Tyr Tyr Asp Gly Leu Gly
        275                 280                 285
Lys Gly Ile Lys Arg His Phe Asn Tyr Ser Ser Leu His Asn Tyr Asn
    290                 295                 300
Ala Phe Cys Asp Phe Ile Glu Phe Lys His Glu Asn Ile Ile Pro Asn
305                 310                 315                 320
Thr Ser Met Tyr Thr Ser Ser Ser Trp
                325
<210>28
<211>329
<212>PRT
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>28
Met Leu Ser Ser Leu Asn Val Leu Gln Ser Ser Phe Arg Gly Lys Thr
1               5                   10                  15
Ala Leu Ser Asn Ser Thr Leu Leu Gln Lys Val Ser Phe Ala Gly Lys
            20                  25                  30
Glu Tyr Pro Leu Glu Pro Ile Asp Glu Lys Thr Pro Ile Leu Phe Gln
        35                  40                  45
Trp Phe Glu Ala Arg Pro Glu Arg Tyr Glu Lys Gly Glu Val Pro Ile
    50                  55                  60
Leu Asn Thr Lys Glu His Pro Tyr Leu Ser Asn Ile Ile Asn Ala Ala
65                  70                  75                  80
Lys Ile Glu Asn Glu Arg Ile Ile Gly Val Leu Val Asp Gly Asn Phe
                85                  90                  95
Thr Tyr Glu Gln Lys Lys Glu Phe Leu Ser Leu Glu Asn Glu Tyr Gln
            100                 105                 110
Asn Ile Lys Ile Ile Tyr Arg Ala Asp Val Asp Phe Ser Met Tyr Asp
        115                 120                 125
Lys Lys Leu Ser Asp Ile Tyr Leu Glu Asn Ile His Lys Gln Glu Ser
    130                 135                 140
Tyr Pro Ala Ser Glu Arg Asp Asn Tyr Leu Leu Gly Leu Leu Arg Glu
145                 150                 155                 160
Glu Leu Lys Asn Ile Pro Glu Gly Lys Asp Ser Leu Ile Glu Ser Tyr
                165                 170                 175
Ala Glu Lys Arg Glu His Thr Trp Phe Asp Phe Phe Arg Asn Leu Ala
            180                 185                 190
Met Leu Lys Ala Gly Ser Leu Phe Thr Glu Thr Gly Lys Thr Gly Cys
        195                 200                 205
His Asn Ile Ser Pro Cys Ser Gly Cys Ile Tyr Leu Asp Ala Asp Met
    210                 215                 220
Ile Ile Thr Asp Lys Leu Gly Val Leu Tyr Ala Pro Asp Gly Ile Ala
225                 230                 235                 240
Val His Val Asp Cys Asn Asp Glu Ile Lys Ser Leu Glu Asn Gly Ala
                245                 250                 255
Ile Val Val Asn Arg Ser Asn His Pro Ala Leu Leu Ala Gly Leu Asp
            260                 265                 270
Ile Met Lys Ser Lys Val Asp Ala His Pro Tyr Tyr Asp Gly Leu Gly
        275                 280                 285
Lys Gly Ile Lys Arg His Phe Asn Tyr Ser Ser Leu His Asp Tyr Asn
    290                 295                 300
Ala Phe Cys Asp Phe Ile Glu  Phe Lys His Glu Asn Ile Ile Pro Asn
305                 310                 315                 320
Thr Ser Met Tyr Thr Cys Ser Ser Trp
                325
<210>29
<211>326
<212>PRT
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>29
Met Leu Ser Pro Ile Arg Thr Thr Phe His Asn Ser Val Asn Ile Val
1               5                   10                  15
Gln Ser Ser Pro Cys Gln Thr Val Ser Phe Ala Gly Lys Glu Tyr Glu
            20                  25                  30
Leu Lys Val Ile Asp Glu Lys Thr Pro Ile Leu Phe Gln Trp Phe Glu
        35                  40                  45
Pro Asn Pro Glu Arg Tyr Lys Lys Asp Glu Val Pro Ile Val Asn Thr
    50                  55                  60
Lys Gln His Pro Tyr Leu Asp Asn Val Thr Asn Ala Ala Arg Ile Glu
65                  70                  75                  80
Ser Asp Arg Met Ile Gly Ile Phe Val Asp Gly Asp Phe Ser Val Asn
                85                  90                  95
Gln Lys Thr Ala Phe Ser Lys Leu Glu Arg Asp Phe Glu Asn Val Met
            100                 105                 110
Ile Ile Tyr Arg Glu Asp Val Asp Phe Ser Met Tyr Asp Arg Lys Leu
        115                 120                 125
Ser Asp Ile Tyr His Asp Ile Ile Cys Glu Gln Arg Leu Arg Thr Glu
    130                 135                 140
Asp Lys Arg Asp Glu Tyr Leu Leu Asn Leu Leu Glu Lys Glu Leu Arg
145                 150                 155                 160
Glu Ile Ser Lys Ala Gln Asp Ser Leu Ile Ser Met Tyr Ala Lys Lys
                165                 170                 175
Arg Asn His Ala Trp Phe Asp Phe Phe Arg Asn Leu Ala Leu Leu Lys
            180                 185                 190
Ala Gly Glu Ile Phe Arg Cys Thr Tyr Asn Thr Lys Asn His Gly Ile
        195                 200                 205
Ser Phe Gly Glu Gly Cys Ile Tyr Leu Asp Met Asp Met Ile Leu Thr
    210                 215                 220
Gly Lys Leu Gly Thr Ile Tyr Ala Pro Asp Gly Ile Ser Met His Val
225                 230                 235                 240
Asp Arg Arg Asn Asp Ser Val Asn Ile Glu Asn Ser Ala Ile Ile Val
                245                 250                 255
Asn Arg Ser Asn His Pro Ala Leu Leu Glu Gly Leu Ser Phe Met His
            260                 265                 270
Ser Lys Val Asp Ala His Pro Tyr Tyr Asp Gly Leu Gly Lys Gly Val
        275                 280                 285
Lys Lys Tyr Phe Asn Phe Thr Pro Leu His Asn Tyr Asn His Phe Cys
    290                 295                 300
Asp Phe Ile Glu Phe Asn His Pro Asn Ile Ile Met Asn Thr Ser Gln
305                 310                 315                 320
Tyr Thr Cys Ser Ser Trp
                325
<210>30
<211>330
<212>PRT
<213>Citrobacter rodentium
<400>30
Met Lys Ile Pro Ser Leu Gln Pro Ser Phe Asn Phe Phe Ala Pro Ala
1               5                   10                  15
Gly Tyr Ser Ala Ala Val Ala Pro Asn Arg Ser Asp Asn Ala Tyr Ala
            20                  25                  30
Asp Tyr Val Leu Asp Ile Gly Lys Arg Ile Pro Leu Ser Ala Glu Asp
        35                  40                  45
Leu Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Val Ile Arg Ala Val Arg Asp Ser Arg
    50                  55                  60
Ser Lys Leu Ile Asp Gln His Thr Val Asp Met Ile Gly Asn Thr Ile
65                  70                  75                  80
Leu Asp Ala Leu Ser Arg Ser Gln Thr Phe Arg Asp Ala Val Ser Tyr
                85                  90                  95
Gly Ile His Asn Lys Glu Val His Ile Gly Cys Ile Lys Tyr Arg Asn
            100                 105                 110
Glu Tyr Glu Leu Asn Gly Glu Ser Pro Val Lys Val Asp Asp Ile Gln
        115                 120                 125
Ser Leu Thr Cys Thr Glu Leu Tyr Glu Tyr Asp Val Gly Gln Glu Pro
    130                 135                 140
Ile Leu Pro Ile Cys Glu Ala Gly Glu Asn Asp Asn Glu Glu Pro Tyr
145                 150                 155                 160
Val Ser Phe Ser Val Ala Pro Asp Thr Asp Ser Tyr Glu Met Pro Ser
                165                 170                 175
Trp Gln Glu Gly Leu Ile His Glu Ile Ile His His Val Thr Gly Ala
            180                 185                 190
Ser Asp Pro Ser Gly Asp Ser Asn Ile Glu Leu Gly Pro Thr Glu Ile
        195                 200                 205
Leu Ala Arg Arg Val Ala Gln Glu Leu Gly Trp Thr Val Pro Asp Phe
    210                 215                 220
Ile Gly Tyr Ala Glu Pro Asp Arg Glu Ala His Leu Arg Gly Arg Asn
225                 230                 235                 240
Leu Asn Ala Leu Arg Gln Ala Ala Met Arg His Glu Asp Asn Glu Arg
                245                 250                 255
Thr Phe Phe Glu Arg Leu Gly Met Ile Ser Asp Arg Tyr Glu Ala Ser
            260                 265                 270
Pro Asp Phe Thr Glu Tyr Ser Ala Val Ser Asn Ile Glu Tyr Gly Phe
        275                 280                 285
Ile Gln Gln His Asp Phe Pro Gly Leu Ala Ile Asp Asp Asn Leu Gln
    290                 295                 300
Asp Ala Asn Gln Ile Gln Leu Tyr His Gly Ala Pro Tyr Ile Phe Thr
305                 310                 315                 320
Phe Gly Asp Val Asp Lys His Asn Gln Arg
                325                 330
<210>31
<211>330
<212>PRT
<213>Enteropathogenic E.coli
<400>31
Met Lys Ile Pro Ser Leu Gln Ser Asn Phe Asn Phe Ser Ala Pro Ala
1               5                   10                  15
Gly Tyr Ser Ala Pro Ile Ala Pro Asn Arg Ala Glu Asn Ala Tyr Ala
            20                  25                  30
Asp Tyr Val Leu Asp Ile Gly Lys Arg Ile Pro Leu Ser Ala Ala Asp
        35                  40                  45
Leu Ser Asn Val Tyr Glu Ser Val Ile Arg Ala Val His Asp Ser Arg
    50                  55                  60
Ser Arg Leu Ile Asp Gln His Thr Val Asp Met Ile Gly Asn Thr Val
65                  70                  75                  80
Leu Asp Ala Leu Ser Arg Ser Gln Thr Phe Arg Asp Ala Val Ser Tyr
                85                  90                  95
Gly Ile His Asn Glu Lys Val His Ile Gly Cys Ile Lys Tyr Arg Asn
            100                 105                 110
Glu Tyr Glu Leu Asn Glu Glu Ser Ser Val Lys Ile Asp Asp Ile Gln
        115                 120                 125
Ser Leu Thr Cys Asn Glu Leu Tyr Glu Tyr Asp Val Gly Gln Glu Pro
    130                 135                 140
Ile Phe Pro Ile Cys Glu Ala Gly Glu Asn Asp Asn Glu Glu Pro Tyr
145                 150                 155                 160
Val Ser Phe Ser Val Ala Pro Asp Thr Asp Ser Tyr Glu Met Pro Ser
                165                 170                 175
Trp Gln Glu Gly Leu Ile His Glu Ile Ile His His Val Thr Gly Ser
            180                 185                 190
Ser Asp Pro Ser Gly Asp Ser Asn Ile Glu Leu Gly Pro Thr Glu Ile
        195                 200                 205
Leu Ala Arg Arg Val Ala Gln Glu Leu Gly Trp Ser Val Pro Asp Phe
    210                 215                 220
Lys Gly Tyr Ala Glu Pro Glu Arg Glu Ala His Leu Arg Leu Arg Asn
225                 230                 235                 240
Leu Asn Ala Leu Arg Gln Ala Ala Met Arg His Glu Glu Asn Glu Arg
                245                 250                 255
Ala Phe Phe Glu Arg Leu Gly Thr Ile Ser Asp Arg Tyr Glu Ala Ser
            260                 265                 270
Pro Asp Phe Thr Glu Tyr Ser Ala Val Ser Asn Ile Gly Tyr Gly Phe
        275                 280                 285
Ile Gln Gln His Asp Phe Pro Gly Leu Ala Ile Asn Asp Asn Leu Gln
    290                 295                 300
Asp Ala Asn Gln Ile Gln Leu Tyr His Gly Ala Pro Tyr Ile Phe Thr
305                 310                 315                 320
Phe Gly Asp Val Asp Lys His Asn Gln Arg
                325                 330
<210>32
<211>330
<212>PRT
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>32
Met Lys Ile Pro Ser Leu Gln Ser Asn Phe Asn Phe Ser Ala Pro Ala
1               5                   10                  15
Gly Tyr Ser Ala Pro Ile Ala Pro Asn Arg Ala Glu Asn Ala Tyr Ala
            20                  25                  30
Asp Tyr Val Leu Asp Ile Gly Lys Arg Ile Pro Leu Ser Ala Ala Asp
        35                  40                  45
Leu Ser Asn Val Tyr Glu Ser Val Ile Arg Ala Val His Asp Ser Arg
    50                  55                  60
Ser Arg Leu Ile Asp Gln His Thr Val Asp Met Ile Gly Asn Thr Val
65                  70                  75                  80
Leu Asp Ala Leu Ser Arg Ser Gln Thr Phe Arg Asp Ala Val Ser Tyr
                85                  90                  95
Gly Ile His Asn Glu Lys Val His Ile Gly Cys Ile Lys Tyr Arg Asn
            100                 105                 110
Glu Tyr Glu Leu Asn Glu Glu Ser Ser Val Lys Ile Asp Asp Ile Gln
        115                 120                 125
Ser Leu Thr Cys Asn Glu Leu Tyr Glu Tyr Asp Val Gly Gln Glu Pro
    130                 135                 140
Ile Phe Pro Ile Cys Glu Ala Gly Glu Asn Asp Asn Glu Glu Pro Tyr
145                 150                 155                 160
Val Ser Phe Ser Val Ala Pro Asp Thr Asp Ser Tyr Glu Met Pro Ser
                165                 170                 175
Trp Gln Glu Gly Leu Ile His Glu Ile Ile His His Val Thr Gly Ser
            180                 185                 190
Ser Asp Pro Ser Gly Asp Ser Asn Ile Glu Leu Gly Pro Thr Glu Ile
        195                 200                 205
Leu Ala Arg Arg Val Ala Gln Glu Leu Gly Trp Ser Val Pro Asp Phe
    210                 215                 220
Lys Gly Tyr Ala Glu Pro Glu Arg Glu Ala His Leu Arg Leu Arg Asn
225                 230                 235                 240
Leu Asn Ala Leu Arg Gln Ala Ala Met Arg His Glu Glu Asn Glu Arg
                245                 250                 255
Ala Phe Phe Glu Arg Leu Gly Thr Ile Ser Asp Arg Tyr Glu Ala Ser
            260                 265                 270
Pro Asp Phe Thr Glu Tyr Ser Ala Val Ser Asn Ile Gly Tyr Gly Phe
        275                 280                 285
Ile Gln Gln His Asp Phe Pro Gly Leu Ala Ile Asn Asp Asn Leu Gln
    290                 295                 300
Asp Ala Asn Gln Ile Gln Leu Tyr His Gly Ala Pro Tyr Ile Phe Thr
305                 310                 315                 320
Phe Gly Asp Val Asp Lys His Asn Gln Gln
                325                 330
<210>33
<211>235
<212>PRT
<213>Citrobacter rodentium
<400>33
Met Arg Pro Thr Ser Leu Asn Leu Thr Leu Pro Ser Leu Pro Leu Pro
1               5                   10                  15
Ser Ser Ser Asn Ser Ile Ser Ala Thr Asp Ile Gln Ser Leu Val Lys
            20                  25                  30
Met Ser Gly Val Arg Trp Val Lys Asn Asn Gln Gln Leu Cys Phe His
        35                  40                  45
Gly Thr Asp Leu Lys Ile Tyr Gln His Leu Glu Ala Ala Leu Asp Lys
    50                  55                  60
Ile Glu Ser Thr Asp Thr Gly Arg Thr Leu Leu Asn Cys Ile Glu Leu
65                  70                  75                  80
Thr Ser Arg Leu Lys Ser Glu Lys Leu Ala Ile His Leu Asp Ser Ala
                85                  90                  95
Glu Leu Gly Val Ile Ala His Cys Asn Ala Asp Ala Glu Asn Ser Arg
            100                 105                 110
Gly Thr Gly Ser Asp Phe His Cys Asn Leu Asn Ala Val Glu Tyr Pro
        115                 120                 125
Cys Gly Gln Gly Ile Ser Leu Val Asp Phe His Ala Cys Ile Val Phe
    130                 135                 140
His Glu Leu Leu His Val Phe His Asn Leu Asn Gly Glu Arg Leu Lys
145                 150                 155                 160
Val Glu Ser Ser Gln Pro Glu Leu Gln Thr His Ser Pro Leu Leu Leu
                165                 170                 175
Glu Glu Ala Arg Thr Val Gly Leu Gly Ala Phe Ser Glu Glu Val Leu
            180                 185                 190
Ser Glu Asn Lys Phe Arg Glu Glu Ile Gly Met Pro Arg Arg Thr Phe
        195                 200                 205
Tyr Pro His Asp Ser Ser Leu Ile His Asp Asp Asn Thr Val Thr Gln
    210                 215                 220
Arg Phe Gln Arg Lys Lys Leu His Pro Leu Leu
225                 230                 235
<210>34
<211>232
<212>PRT
<213>Enteropathogenic E.coli
<400>34
Met Arg Pro Thr Ser Leu Asn Leu Val Leu His Gln Ser Ser Thr Ser
1               5                   10                  15
Ser Ser Met Ser Asp Thr Asp Ile Glu Ser Leu Val Lys Ala Ser Ser
            20                  25                  30
Val Gln Trp Ile Lys Asn Asn Pro Gln Leu Arg Phe Gln Gly Thr Asp
        35                  40                  45
His Asn Ile Tyr Gln Gln Ile Glu Ala Ala Leu Asp Lys Ile Gly Ser
    50                  55                  60
Thr Glu Thr Gly Arg Val Leu Leu Asn Ala Ile Glu Ser Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Leu Lys Ser Glu Thr Val Val Ile His Leu Asn Ser Ser Arg Leu Gly
                85                  90                  95
Val Met Ala His Arg Asp Ile Asp Ala Glu Asn His Arg Gly Thr Gly
            100                 105                 110
Ser Asp Phe His Cys Asn Leu Asn Ala Val Glu Tyr Pro Cys Gly Glu
        115                 120                 125
Gly Ile Ser Val Val Asp Phe His Ala Thr Ile Val Phe His Glu Leu
    130                 135                 140
Leu His Val Phe His Asn Leu Asn Gly Glu Arg Leu Lys Val Glu Ser
145                 150                 155                 160
Ser Arg Pro Glu Ser Gln Lys Tyr Ser Pro Leu Leu Leu Glu Glu Ala
                165                 170                 175
Arg Thr Val Gly Leu Gly Ala Phe Ser Glu Glu Val Leu Ser Glu Asn
            180                 185                 190
Lys Phe Arg Glu Glu Ile Gly Met Pro Arg Arg Thr Ser Tyr Pro His
        195                 200                 205
Asp Ser Ala Leu Ile His Asp Asp Asn Thr Val Ser Leu Gly Phe Gln
    210                 215                 220
Gln Val Arg Leu His Pro Leu Leu
225                 230
<210>35
<211>232
<212>PRT
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(208)..(208)
<223>Xaa＝Arg or His
<400>35
Met Arg Pro Thr Ser Leu Asn Leu Val Leu His Gln Ser Ser Arg Ser
1               5                   10                  15
Ser Ser Met Ser Asp Thr Asp Ile Glu Ser Leu Val Lys Ala Ser Ser
            20                  25                  30
Val Gln Trp Ile Lys Asn Asn Pro Gln Leu Arg Phe Gln Gly Thr Asp
        35                  40                  45
His Asn Ile Tyr Gln Gln Ile Glu Ala Ala Leu Asp Lys Ile Gly Ser
    50                  55                  60
Thr Glu Thr Gly Arg Val Leu Leu Asn Ala Ile Glu Ser Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Leu Lys Ser Glu Thr Val Val Ile His Leu Asn Ser Ser Arg Leu Gly
                85                  90                  95
Val Met Ala His Arg Asp Ile Asp Ala Glu Asn His Arg Gly Thr Gly
            100                 105                 110
Ser Asp Phe His Cys Asn Leu Asn Ala Val Glu Tyr Pro Cys Gly Glu
        115                 120                 125
Gly Ile Ser Val Val Asp Phe His Ala Thr Ile Val Phe His Glu Leu
    130                 135                 140
Leu His Val Phe His Asn Leu Asn Gly Glu Arg Leu Lys Val Glu Ser
145                 150                 155                 160
Ser Arg Ala Glu Ser Gln Lys Tyr Ser Pro Leu Leu Leu Glu Glu Ala
                165                 170                 175
Arg Thr Val Gly Leu Gly Ala Phe Ser Glu Glu Val Leu Ser Glu Asn
            180                 185                 190
Lys Phe His Glu Glu Ile Gly Met Pro Arg Arg Thr Ser Tyr Pro Xaa
        195                 200                 205
Asp Ser Ala Leu Ile His Asp Asp Asn Thr Val Ser Leu Gly Phe Gln
    210                 215                 220
Gln Val Arg Leu His Pro Leu Leu
225                 230
<210>36
<211>168
<212>PRT
<213>Citrobacter rodentium
<400>36
Tyr Phe Asn Glu Ser Pro Asn Val Tyr Asp Lys Lys Tyr Ile Ser Gly
1               5                   10                  15
Val Thr Arg Gly Val Ala Glu Leu Lys Gln Glu Gly Phe Ile Asn Glu
            20                  25                  30
Lys Ala Arg Arg Leu Ala Tyr Met Gln Ala Met Tyr Ser Val Cys Pro
        35                  40                  45
Glu Glu Phe Lys Pro Ile Ser Arg Asn Glu Ala Ser Thr Pro Glu Gly
    50                  55                  60
Ser Trp Leu Thr Val Ile Ser Gly Lys Arg Pro Met Gly Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Val Asp Ser Leu Tyr His Pro Asp Leu His Ala Leu Cys Glu Leu Pro
                85                  90                  95
Asp Ile Cys Cys Lys Ile Phe Pro Lys Glu Asn Asn Asp Phe Leu Tyr
            100                 105                 110
Ile Val Ile Val Tyr Arg Asn Asp Ser Pro Leu Gly Glu Gln Arg Ala
        115                 120                 125
Asn Arg Phe Ile Glu Leu Tyr Asn Ile Lys Arg Asp Ile Met Gln Glu
    130                 135                 140
Leu Asn Tyr Glu Ser Pro Glu Leu Lys Ala Val Lys Ser Glu Met Ile
145                 150                 155                 160
Ile Ala Arg Glu Met Gly Glu Ile
                165
<210>37
<211>154
<212>PRT
<213>Citrobacter rodentium
<400>37
Asn Val Tyr Asp Lys Lys Tyr Ile Ser Gly Val Thr Arg Gly Val Ala
1               5                   10                  15
Glu Leu Lys Gln Glu Gly Phe Ile Asn Glu Lys Ala Arg Arg Leu Ala
            20                  25                  30
Tyr Met Gln Ala Met Tyr Ser Val Cys Pro Glu Glu Phe Lys Pro Ile
        35                  40                  45
Ser Arg Asn Glu Ala Ser Thr Pro Glu Gly Ser Trp Leu Thr Val Ile
    50                  55                  60
Ser Gly Lys Arg Pro Met Gly Gln Phe Ser Val Asp Ser Leu Tyr His
65                  70                  75                  80
Pro Asp Leu His Ala Leu Cys Glu Leu Pro Asp Ile Cys Cys Lys Ile
                85                  90                  95
Phe Pro Lys Glu Asn Asn Asp Phe Leu Tyr Ile Val Ile Val Tyr Arg
            100                 105                 110
Asn Asp Ser Pro Leu Gly Glu Gln Arg Ala Asn Arg Phe Ile Glu Leu
        115                 120                 125
Tyr Asn Ile Lys Arg Asp Ile Met Gln Glu Leu Asn Tyr Glu Ser Pro
    130                 135                 140
Glu Leu Lys Ala Val Lys Ser Glu Met Ile
145                 150
<210>38
<211>224
<212>PRT
<213>Enteropathogenic E.coli
<400>38
Met Ile Asn Pro Val Thr Asn Thr Gln Gly Val Ser Pro Ile Asn Thr
1               5                   10                  15
Lys Tyr Ala Glu His Val Val Lys Asn Ile Tyr Pro Lys Ile Lys His
            20                  25                  30
Asp Tyr Phe Asn Glu Ser Pro Asn Ile Tyr Asp Lys Lys Tyr Ile Ser
        35                  40                  45
Gly Ile Thr Arg Gly Val Ala Glu Leu Lys Gln Glu Glu Phe Val Asn
    50                  55                  60
Glu Lys Ala Arg Arg Phe Ser Tyr Met Lys Thr Met Tyr Ser Val Cys
65                  70                  75                  80
Pro Glu Ala Phe Glu Pro Ile Ser Arg Asn Glu Ala Ser Thr Pro Glu
                85                  90                  95
Gly Ser Trp Leu Thr Val Ile Ser Gly Lys Arg Pro Met Gly Gln Phe
            100                 105                 110
Ser Val Asp Ser Leu Tyr Asn Pro Asp Leu His Ala Leu Cys Glu Leu
        115                 120                 125
Pro Asp Ile Cys Cys Lys Ile Phe Pro Lys Glu Asn Asn Asp Phe Leu
    130                 135                 140
Tyr Ile Val Val Val Tyr Arg Asn Asp Ser Pro Leu Gly Glu Gln Arg
145                 150                 155                 160
Ala Asn Arg Phe Ile Glu Leu Tyr Asn Ile Lys Arg Asp Ile Met Gln
                165                 170                 175
Glu Leu Asn Tyr Glu Leu Pro Glu Leu Lys Ala Val Lys Ser Glu Met
            180                 185                 190
Ile Ile Ala Arg Glu Met Gly Glu Ile Phe Ser Tyr Met Pro Gly Glu
        195                 200                 205
Ile Asp Ser Tyr Met Lys Tyr Ile Asn Asn Lys Leu Ser Lys Ile Glu
    210                 215                 220
<210>39
<211>224
<212>PRT
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>39
Met Ile Asn Pro Val Thr Asn Thr Gln Gly Val Ser Pro Ile Asn Thr
1               5                   10                  15
Lys Tyr Ala Glu His Val Val Lys Asn Ile Tyr Pro Glu Ile Lys His
            20                  25                  30
Asp Tyr Phe Asn Glu Ser Pro Asn Ile Tyr Asp Lys Lys Tyr Ile Ser
        35                  40                  45
Gly Ile Thr Arg Gly Val Ala Glu Leu Lys Gln Glu Glu Phe Val Asn
    50                  55                  60
Glu Lys Ala Arg Arg Phe Ser Tyr Met Lys Thr Met Tyr Ser Val Cys
65                  70                  75                  80
Pro Glu Ala Phe Glu Pro Ile Ser Arg Asn Glu Ala Ser Thr Pro Glu
                85                  90                  95
Gly Ser Trp Leu Thr Val Ile Ser Gly Lys Arg Pro Met Gly Gln Phe
            100                 105                 110
Ser Val Asp Ser Leu Tyr Asn Pro Asp Leu His Ala Leu Cys Glu Leu
        115                 120                 125
Pro Asp Ile Cys Cys Lys Ile Phe Pro Lys Glu Asn Asn Asp Phe Leu
    130                 135                 140
Tyr Ile Val Val Val Tyr Arg Asn Asp Ser Pro Leu Gly Glu Gln Arg
145                 150                 155                 160
Ala Asn Arg Phe Ile Glu Leu Tyr Asn Ile Lys Arg Asp Ile Met Gln
                165                 170                 175
Glu Leu Asn Tyr Glu Leu Pro Glu Leu Lys Ala Val Lys Ser Glu Met
            180                 185                 190
Ile Ile Ala Arg Glu Met Gly Glu Ile Phe Ser Tyr Met Pro Gly Glu
        195                 200                 205
Ile Asp Ser Tyr Met Lys Tyr Ile Asn Asn Lys Leu Ser Lys Ile Glu
    210                 215                 220
<210>40
<211>188
<212>PRT
<213>Citrobacter rodentium
<400>40
Met Leu Pro Thr Ser Gly Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ser Trp Met Tyr
1               5                   10                  15
Ile Ser Gly Lys Glu Asn Pro Ser Thr Pro Glu Ser Val Ser Glu Leu
            20                  25                  30
Asn His Asn His Phe Leu Ser Pro Glu Leu Gln Glu Lys Leu Asp Val
        35                  40                  45
Met Phe Ala Ile Tyr Ser Cys Ala Arg Asn Asn Asp Glu Arg Glu Asn
    50                  55                  60
Ile Tyr Pro Glu Leu Arg Asp Phe Val Ser Ser Leu Met Asp Lys Arg
65                  70                  75                  80
Asn Asn Val Phe Glu Val Ile Asn Glu Asp Thr Asp Glu Val Thr Gly
                85                  90                  95
Ala Leu Arg Ala Gly Met Thr Ile Glu Asp Arg Asp Ser Tyr Ile Arg
            100                 105                 110
Asp Leu Phe Phe Leu His Ser Leu Lys Val Lys Ile Glu Glu Ser Arg
        115                 120                 125
Gln Asp Lys Glu Asp Trp Lys Cys Lys Val Tyr Asp Leu Leu Cys Pro
    130                 135                 140
His His Ser Ser Glu Leu Tyr Gly Asp Leu Arg Ala Ile Lys Cys Leu
145                 150                 155                 160
Val Glu Gly Cys Ser Asp Asp Phe Ser Pro Phe Asp Thr Ile Lys Val
                165                 170                 175
Pro Asp Leu Thr Tyr Asn Lys Gly Ser Leu Gln Cys
            180                 185
<210>41
<211>171
<212>PRT
<213>Citrobacter rodentium
<400>41
Ala Asn Leu Tyr Ser Trp Met Tyr Ile Ser Gly Lys Glu Asn Pro Ser
1               5                   10                  15
Thr Pro Glu Ser Val Ser Glu Leu Asn His Asn His Phe Leu Ser Pro
            20                  25                  30
Glu Leu Gln Glu Lys Leu Asp Val Met Phe Ala Ile Tyr Ser Cys Ala
        35                  40                  45
Arg Asn Asn Asp Glu Arg Glu Asn Ile Tyr Pro Glu Leu Arg Asp Phe
    50                  55                  60
Val Ser Ser Leu Met Asp Lys Arg Asn Asn Val Phe Glu Val Ile Asn
65                  70                  75                  80
Glu Asp Thr Asp Glu Val Thr Gly Ala Leu Arg Ala Gly Met Thr Ile
                85                  90                  95
Glu Asp Arg Asp Ser Tyr Ile Arg Asp Leu Phe Phe Leu His Ser Leu
            100                 105                 110
Lys Val Lys Ile Glu Glu Ser Arg Gln Asp Lys Glu Asp Trp Lys Cys
        115                 120                 125
Lys Val Tyr Asp Leu Leu Cys Pro His His Ser Ser Glu Leu Tyr Gly
    130                 135                 140
Asp Leu Arg Ala Ile Lys Cys Leu Val Glu Gly Cys Ser Asp Asp Phe
145                 150                 155                 160
Ser Pro Phe Asp Thr Ile Lys Val Pro Asp Leu
                165                 170
<210>42
<211>189
<212>PRT
<213>Enteropathogenic E.coli
<400>42
Met Leu Pro Thr Ser Gly Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ser Trp Met Tyr
1               5                   10                  15
Val Ser Gly Arg Gly Asn Pro Ser Thr Pro Glu Ser Val Ser Glu Leu
            20                  25                  30
Asn His Asn His Phe Leu Ser Pro Glu Leu Gln Asp Lys Leu Asp Val
        35                  40                  45
Met Val Ser Ile Tyr Ser Cys Ala Arg Asn Asn Asn Glu Leu Glu Glu
    50                  55                  60
Ile Phe Gln Glu Leu Ser Ala Phe Val Ser Gly Leu Met Asp Lys Arg
65                  70                  75                  80
Asn Ser Val Phe Glu Val Arg Asn Glu Asn Thr Asp Glu Val Val Gly
                85                  90                  95
Ala Leu Arg Ala Gly Met Thr Ile Glu Asp Arg Asp Ser Tyr Ile Arg
            100                 105                 110
Asp Leu Phe Phe Leu His Ser Leu Lys Val Lys Ile Glu Glu Ser Arg
        115                 120                 125
Gln Gly Lys Glu Asp Ser Lys Cys Lys Val Tyr Asn Leu Leu Cys Pro
    130                 135                 140
His His Ser Ser Glu Leu Tyr Gly Asp Leu Arg Ala Met Lys Cys Leu
145                 150                 155                 160
Val Glu Gly Cys Ser Asp Asp Phe Asn Pro Phe Asp Ile Ile Arg Val
                165                 170                 175
Pro Asp Leu Thr Tyr Asn Lys Gly Ser Leu Gln Cys Gly
            180                 185
<210>43
<211>189
<212>PRT
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>43
Met Leu Pro Thr Ser Gly Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ser Trp Met Tyr
1               5                   10                  15
Val Ser Gly Arg Gly Asn Pro Ser Thr Pro Glu Ser Val Ser Glu Leu
            20                  25                  30
Asn His Asn His Phe Leu Ser Pro Glu Leu Gln Asp Lys Leu Asp Val
        35                  40                  45
Met Val Ser Ile Tyr Ser Cys Ala Arg Asn Asn Asn Glu Leu Glu Glu
    50                  55                  60
Ile Phe Gln Glu Leu Ser Ala Phe Val Ser Gly Leu Met Asp Lys Arg
65                  70                  75                  80
Asn Ser Val Phe Glu Val Arg Asn Glu Asn Thr Asp Glu Val Val Gly
                85                  90                  95
Ala Leu Arg Ala Gly Met Thr Ile Glu Asp Arg Asp Ser Tyr Ile Arg
            100                 105                 110
Asp Leu Phe Phe Leu His Ser Leu Lys Val Lys Ile Glu Glu Ser Arg
        115                 120                 125
Gln Gly Lys Glu Asp Ser Lys Cys Lys Val Tyr Asn Leu Leu Cys Pro
    130                 135                 140
His His Ser Ser Glu Leu Tyr Gly Asp Leu Arg Ala Met Lys Cys Leu
145                 150                 155                 160
Val Glu Gly Cys Ser Asp Asp Phe Asn Pro Phe Asp Ile Ile Arg Val
                165                 170                 175
Pro Asp Leu Thr Tyr Asn Lys Gly Ser Leu Gln Cys Gly
            180                 185
<210>44
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer Z6024F
<400>44
agatctgaag gagatattat gaacattcaa ccgaccatac                            40
<210>45
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer Z6024R
<400>45
ctcgaggact cttgtttctt cgattatatc aaag                                  34
<210>46
<211>28
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer NT10
<400>46
ccggtacctc taaccattga cgcactcg                                        28
<210>47
<211>29
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer NT11
<400>47
aacctgcaga actaggtatc tctaatgcc                                       29
<210>48
<211>29
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer NT12
<400>48
aacctgcagc tgactatcct cgtatatgg                                       29
<210>49
<211>27
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer NT13
<400>49
ccgagctcag gtaatgagac tgtcagc                                         27
<210>50
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer del1F
<400>50
ggtaccacca cacagaataa tc                                              22
<210>51
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer del1R
<400>51
cgctagccta tatactgctg ttggtt                                          26
<210>52
<211>28
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer del2F
<400>52
gctagctgac aggcaactct tggactgg                                      28
<210>53
<211>29
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer del2R
<400>53
gagctcaaca taatttgatg gattatgat                                     29
<210>54
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>54
ttccatatga acattcaacc gacc                                          24
<210>55
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>55
ggaattcaat aatagctgcc atcc                                          24
<210>56
<211>135
<212>PRT
<213>Salmonella
<400>56
Met Glu Ser Lys Asn Ser Asp Tyr Val Ile Pro Asp Ser Val Lys Asn
1               5                   10                  15
Tyr Asn Gly Glu Pro Leu Tyr Ile Leu Val Ser Leu Trp Cys Lys Leu
            20                  25                  30
Gln Glu Lys Trp Ile Ser Arg Asn Asp Ile Ala Glu Ala Phe Gly Ile
        35                  40                  45
Asn Leu Arg Arg Ala Ser Phe Ile Ile Thr Tyr Ile Ser Arg Arg Lys
    50                  55                  60
Glu Lys Ile Ser Phe Arg Val Arg Tyr Val Ser Tyr Gly Asn Leu His
65                 70                 75                 80
Tyr Lys Arg Leu Glu Ile Phe Ile Tyr Asn Val Asn Leu Glu Ala Ala
                85                 90                 95
Pro Thr Glu Ser His Val Ser Thr Gly Pro Lys Arg Lys Thr Leu Arg
            100                105                110
Val Gly Asn Gly Ile Val Gly Gln Ser Ser Ile Trp Asn Glu Met Ile
        115                120                125
Met Arg Arg Lys Lys Glu Ser
    130                135
<210>57
<211>131
<212>PRT
<213>Enterobacteriaceae
<400>57
Met Cys Glu Gly Tyr Val Glu Lys Pro Leu Tyr Leu Leu Ile Ala Glu
1               5                   10                  15
Trp Met Met Ala Glu Asn Arg Trp Val Ile Ala Arg Glu Ile Ser Ile
            20                  25                  30
His Phe Asp Ile Glu His Ser Lys Ala Val Asn Thr Leu Thr Tyr Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Glu Val Thr Glu Ile Ser Cys Glu Val Lys Met Ile Pro Asn
    50                  55                  60
Lys Leu Glu Gly Arg Gly Cys Gln Cys Gln Arg Leu Val Lys Val Val
65                  70                  75                  80
Asp Ile Asp Glu Gln Ile Tyr Ala Arg Leu Arg Asn Asn Ser Arg Glu
                85                  90                  95
Lys Leu Val Gly Val Arg Lys Thr Pro Arg Ile Pro Ala Val Pro Leu
            100                 105                 110
Thr Glu Leu Asn Arg Glu Gln Lys Trp Gln Met Met Leu Ser Lys Ser
        115                 120                 125
Met Arg Arg
    130
<210>58
<211>170
<212>PRT
<213>Citrobacter rodentium
<400>58
Met Cys Pro Asp Asn Thr His Ala Lys Lys Gln Tyr Leu Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Asn Asp Ile His Tyr Pro Gly Gln Thr Asn His Asp Ala Cys Phe Ile
            20                  25                  30
Pro Val Ser Val Arg Gln Tyr Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Ile Ile Val
        35                  40                  45
Ala His Trp Cys Leu Leu Gln Gln Asn Trp Val Gln Arg Asn Gln Ile
    50                  55                  60
Ala Glu Ala Phe His Ile Thr Ala Arg Arg Ala Ser Tyr Leu Ile Ala
65                  70                  75                  80
Tyr Leu Arg Ser Lys Thr Ser Arg Val Val Ser Ile Cys Arg His Gln
                85                  90                  95
Thr Leu Pro Asn Lys Ala Arg Arg Tyr Glu Ile Tyr Val Ile Arg Val
            100                 105                 110
Leu Asp Ser Pro Thr Pro Ser Thr Arg Arg Glu Lys Ala Gly Pro Pro
        115                 120                 125
Leu Val Ser Lys Arg Arg Val Gly Asn Gly Asp Arg Ser Met Ala Asn
    130                 135                 140
Glu Leu Trp Asn Arg Leu Cys Ser Asn Arg Asn Ala Gly Lys Ile Leu
145                 150                 155                 160
Lys Lys Lys Glu Asp Glu Asp Asp Gly Thr
                165                 170
<210>59
<211>12
<212>PRT
<213>Citrobacter rodentium
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>Xaa＝Ile or Leu
<400>59
Gln Gln Glu Asn Ala Pro Ser Ser Xaa Gln Thr Arg
1               5                   10
<210>60
<211>981
<212>DNA
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>60
atgctttcac cgataaggac aactttccat aactcagtaa atatagtgca gagttcaccc     60
tgtcaaacgg tttcttttgc aggaaaggaa tatgagttaa aggtcattga tgaaaaaacg    120
cctattcttt ttcagtggtt tgaacctaat cctgaacgat ataagaaaga tgaggttcca    180
atagttaata ctaagcagca tccctattta gataatgtca caaatgcggc aaggatagag    240
agtgatcgta tgataggtat ttttgttgat ggcgattttt cagtcaacca aaagactgct    300
ttttcaaaat tggaacgaga ttttgaaaat gtaatgataa tctatcggga agatgttgac    360
ttcagtatgt atgacagaaa actatcagat atttatcatg atattatatg tgaacaaagg    420
ttacgaactg aagacaaaag agatgaatac ttgttgaatc tgttagagaa agagctgagg    480
gaaatttcaa aggcgcagga ttctttgatt tctatgtatg caaagaaaag aaatcatgca    540
tggtttgatt tcttcagaaa tttagcctta ttaaaagcag gagagatatt caggtgcaca    600
tataatacaa agaatcacgg tatttcattc ggggaggggt gtatctatct tgatatggat    660
atgatactta caggtaagct tggtacaata tatgctcctg atggaatttc aatgcatgtg    720
gatcgtcgta atgatagtgt aaatattgaa aatagtgcaa taattgttaa ccgtagtaat    780
catcctgctc tacttgaggg actttctttt atgcatagta aagtagatgc tcatccatat    840
tatgatggtt tggggaaagg agttaagaaa tattttaatt ttacaccatt acataattat    900
aatcattttt gtgactttat tgagtttaac caccctaata taatcatgaa cacaagtcag    960
tatacatgca gttcatggta a                                              981
<210>61
<211>531
<212>DNA
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>61
atgaatgtcc ttcgagctca agtagcatct agcggtcgag gggagtttac attaggtaat     60
gagactgtca gcattgtatt taatgaaacc gatgggcgtt ttctatccag cggcagtagt    120
gggggattgc ttactgagtt attcctttat gggtttaata acggccctga agctcttcgc    180
gataggatgc tcagtatgct ttcggactca ggtgaagcac aatcgcaaga gagtattcag    240
gacaaaatat ctcaatgtaa gtttcctgtt agttcaggaa atttccagtg cccgccagag    300
tctattcagt gtccaattac actagagaga cccgaagaag gagtgtttgt caaaaattca    360
gatagttcgg cagtatgctg cttatttgat tttgatgcat tttctcgttt agctagtgaa    420
ggctcatatc atccactgac ccgagaacca ataacggcat caatgattat aagtcctgat    480
aaatgtgttt atgatcctat caagggaaac ttcattataa aagatagtta a             531
<210>62
<211>912
<212>DNA
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>62
atgttatcgc cctcttctat aaatttggga tgttcatgga attctttaac cagaaacctg     60
acttcgcctg ataatcgtgt tttatcctct gtaagggatg ctgctgttca ctctgatagc    120
gggacgcaag taacggttgg caacagaaca tatcgtgttg tggtcactga taataagttt    180
tgcgttacaa gagaaagtca tagtggttgt tttactaatc tgttgcacag gttgggatgg    240
cctaagggag agattagcag aaaaattgag gctatgctga atacatcgcc agtgagcacg    300
actatagaaa gaggctctgt tcattcgaac agacctgatt tacctccagt ggattatgcg    360
cagccggagt tacctccagc ggattatact caatcagagt tgccgagggt tagcaacaat    420
aaatcacccg tgccaggtaa tgttattggt aaaggtggta atgctgtcgt gtatgaagat    480
atggaagata caacaaaagt gttgaagatg tttactatat ctcaaagcca tgaagaggtg    540
acaagcgaag ttcgttgttt caatcagtat tatggttccg ggagtgcaga gaaaatatat    600
aatgataatg gaaatgttat tggtattaga atgaataaaa taaatgggga atctcttttg    660
gatattccat cattaccagc acaagctgaa caggctattt acgatatgtt tgacagactg    720
gagaaaaaag gaattctttt tgttgataca acagaaacaa atgttttata tgatcgtatg    780
agaaatgaat ttaatccaat agatatatca tcttataatg tttctgatat ttcatggagt    840
gaacatcaag tcatgcaatc ttatcacgga ggaaagctgg atcttattag tgtagtatta    900
agtaagatat aa                                                        912
<210>63
<211>882
<212>DNA
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>63
atgttatcgc catattctgt aaatttggga tgttcatgga attctttaac cagaaacctg     60
acttcgcctg ataatcgtgt tttatcctct gtaagggatg ctgccgttca ttctgataat    120
ggggcgcaag taaaggttgg caacagaaca tatcgtgttg ttgccaccga taataagttt    180
tgcgttacaa gagaaagtca tagtggttgt tttactaatc tgttgcacag gctgggatgg    240
cctaaggggg agattagcag gaaaattgag gtcatgctga atgcatcacc agtgagcgct    300
gctatggaaa gaggcattgt tcattcgaac agacctgatt tacctcctgt tgattatgca    360
ccgccagagt taccgagtgt ggactataac aggttgtcag tacctggtaa tgttattggc    420
aaagggggga acgctgtagt atatgaagat gctgaggatg caacaaaagt cctgaagatg    480
tttactacat ctcaaagcaa tgaagaggtg acaagcgaag ttcgttgctt caaccaatat    540
tatggtgccg ggagtgcaga aaaaatatat ggcaataatg gtgatattat tggtattaga    600
atggataaaa taaatggaga atcgctttta aatatttcgt ccttgccagc acaggctgag    660
catgctattt acgatatgtt tgatagactg gagcaaaaag gaattctttt tgtcgataca    720
acagagacaa atgtcttata tgaccgcgcg aagaatgagt ttaatccaat agatatatca    780
tcttataatg tttccgaccg ttcatggagt gaaagtcaaa taatgcaatc ttatcatggc    840
ggaaagcaag atcttattag tgtggtatta agtaaaattt ag                       882
<210>64
<211>153
<212>DNA
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>64
atggtaatgc ctggattagt atcatatata tcatcgactt cattcgcgaa tgagatggcg     60
gagatgcgtc agcaggtaat ggaagggcag attggtggat ttctcctggg aggggagaga    120
gttagagttt cttatttatt tcaattgcat taa                                 153
<210>65
<211>576
<212>DNA
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>65
atgccattaa cctcagatat tagatcacat tcatttaatc ttggggtgga ggttgttcgt     60
gcccgaattg tagccaatgg gcgcggagat attacagtcg gtggtgaaac tgtcagtatt    120
gtgtatgatt ctactaatgg gcgcttttca tccagtggcg gtaatggcgg attgctttct    180
gagttattgc ttttgggatt taatagtggt cctcgagccc ttggtgagag aatgctaagt    240
atgctttcgg actcaggtga agcacaatcg caagagagta ttcagaacaa aatatctcaa    300
tgtaagtttt ctgtttgtcc agagagactt cagtgcccgc ttgaggctat tcagtgtcca    360
attacactgg agcagcctga aaaaggtatt tttgtgaaga attcagatgg ttcagatgta    420
tgtactttat ttgatgccgc tgcattttct cgtttggttg gtgaaggctt accccaccca    480
ctgacccggg aaccaataac ggcatcaata attgtaaaac atgaagaatg catttatgac    540
gataccagag gaaacttcat tataaagggt aattga                              576
<210>66
<211>630
<212>DNA
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<220>
<221>misc_feature
<222>(439)..(439)
<223>n＝any nucleotide
<400>66
atgcctgtta ccaccttaag tatcccaagt atatctcaat tatctcctgc aagagtacag     60
tctttgcagg atgcagccag acttgaaagt ggaataagaa tatccattgg tagtggccaa    120
tattctgttc actatgtcca actactggat ggattttcag ttgaaccggt gagaggaggc    180
ttactggata ggctattggg gcgtgagcat cgaatggata gaagggctgt ggctctggaa    240
aggcaattaa atggaggtgt cgatttttta agtagtgtta ataactattt tcagagtgtc    300
atggcagaac acagagaaaa taaaacaggt aataaaatat taatggaaaa aataaattct    360
tgtgtatttg gaacggattc taatcacttt tcttgcccgg agtcattttt gacatgcccg    420
ataacgctgg acacacctna gactggagtg ttcatgagaa actcacgagg tgctgagata    480
tgctctctat atgataagga tgcgttagtg caacttgttg aaactggtgg aactcatcct    540
ctgagtcgag aacctataac agaatcaatg attatgagaa aagacgaatg tcactttgat    600
gcaaaaagag aagctttttg ttgtaagtga                                     630
<210>67
<211>642
<212>DNA
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>67
atgcctgtag atttaacgcc ttatatttta cctggggtta gttttttgtc tgacattcct     60
caagaaacct tgtctgagat acgtaatcag actattcgtg gagaagctca agtaagactg    120
ggtgagttga tggtgtcaat acgacctatg caggtaaatg gatattttat gggaagtctt    180
aaccaggatg gtttatcgaa tgataacatc cagattggcc ttcaatatat agaacatatt    240
gaacgtacac ttaatcatgg tagtttgaca agccgtgaag ttacagtact gcgtgaaatt    300
gagatgctcg aaaatatgga attgctttct aactaccagt tagaggagtt gttagataaa    360
attgaagtat gtgcatttaa tgtggagcat gcacaattgc aagtgccaga gagcttacga    420
acatgccctg ttacattatg tgaaccagaa gatggggtat ttatgaggaa ttcaatgaat    480
tcaaatgttt gtatgttgta tgataaaatg tcattaatat atcttgttaa aacaagggcg    540
gctcatcctt tgagcaggga atcaatcgca gtttcaatga ttgtaggaag agataattgt    600
gcttttgact ctgacagagg taacttcgtt ttaaaaaatt aa                       642
<210>68
<211>642
<212>DNA
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>68
atgcctgtag atttaacgcc ttatatttta cctggggtta gttttttgtc tgacattcct     60
caagaaacct tgtctgagat acgtaatcag actattcgtg gagaagctca aataagactg    120
ggtgagttga tggtgtcaat acgacctatg caggtaaatg gatattttat gggaagtctt    180
aaccaggatg gtttatcgaa tgataatatc cagattggcc ttcaatatat agaacatatt    240
gaacgtacac ttaatcatgg tagtttgaca agccgtgaag ttacagtact gcgtgaaatt    300
gagatgctcg aaaatatgga tttgctttct aactaccagt tagaggagtt gttagataaa    360
attgaagtat gtgcatttaa tgtggagcat gcacaattgc aagtgccaga gagcttacga    420
acatgccctg ttacattatg tgaaccagaa gatggggtat ttatgaggaa ttcaatgaat    480
tcaaatgttt gtatgttgta tgataaaatg gcattaatac atcttgttaa aacaagggcg    540
gctcatcctt tgagcaggga atcaatcgca gtttcaatga ttgtaggaag agataattgt    600
gcttttgacc ctgacagagg taacttcgtt ttaaaaaatt aa                       642
<210>69
<211>630
<212>DNA
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>69
atgcctgtta ccaccttaag tatcccaagt atatctcaat tatctcctgc aggagtacag     60
tctttgcagg atgctgccag acttgaaagt ggaataagaa tatccattgg tagtggccaa    120
tattctgttc actatgtcca gctactggat ggattttcag ttgaaccggt gagaggaggc    180
ttactggata ggctattggg gcgtgagcat cgaatggaga gaagggctgt ggctctggaa    240
aggcaattaa atggaggtgt cgatttttta agtagtgtta ataactattt tcagagtgtc    300
atggcagaac acagagaaaa taaaacaagt aataaaatat taatggaaaa aataaattct    360
tgtttattta gacctgattc taatcacttt tcttgcccgg agtcattttt gacatgcccg    420
ataacgctgg acacacctga gactggggtg ttcatgagaa actcacgagg tgctgagata    480
tgctctctat atgataagga cgcgttagtg caacttgttg aaactggtgg agctcatcct    540
ctgagtcgag aacctataac agaatcaatg attatgagaa aagatgaatg tcactttgat    600
acaaaaagag aagctttttg ttgtaagtga                                     630
<210>70
<211>576
<212>DNA
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>70
atgccattaa cctcagatat tagatcacat tcatttaatc ttggggtgga ggttgttcgt     60
gcccgaattg tagccaatgg gcgcggagat attacagtcg gtggtgaaac tgtcagtatt    120
gtgtatgatt ctactaatgg gcgcttttca tccagtggcg gtaatggcgg attgctttct    180
gagttattgc ttttgggatt taatagtggt cctcgagccc ttggtgagag aatgctaagt    240
atgctttcgg actcaggtga agcacaatcg caagagagta ttcagaacaa aatatctcaa    300
tgtaagtttt ctgtttgtcc agagagactt cagtgcccgc ttgaggctat tcartgtcca    360
attacactgg agcagcctga aaaaggtatt tttgtgaaga attcagatgg ttcagatgta    420
tgtactttat ttgatgccgc tgcattttct cgtttggttg gtgaaggctt accccaccca    480
ctgacccggg aaccaataac ggcatcaata attgtaaaac atgaagaatg catttatgac    540
gataccagag gaaacttcgt tataaagggt aattga                              576
<210>71
<211>510
<212>DNA
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>71
atggacgctt ttattgtaga tcctgttcaa ggggaactat attcgggttt aagccataca     60
gaactagccg atatcattag attggctgat tctgttgaaa atcaattgaa tggaggcaat    120
tcatttcttg atgtattcag tacatatatg gggcaggtta tttctgaatt tatgcatagt    180
aatgataaca gaattgaatt gttacagcgg cgattacatt catgttcatt tttagttaat    240
attgaagaaa tgtcttacat agatgaagca ttacagtgcc cgattacgct ggcaattcct    300
caacgaggtg tttttttaag aaatgctgaa ggttccagag tatgtagttt atatgatgaa    360
atggctcttt ctcgtataat taatgatggg atgcatcacc cactaagcag agagccaata    420
acattatcaa tgcttgtggc cagagagcag tgtgagtttg attgcagtat cggtcacttt    480
acggtgagga gtgattgtta ttcagtgtag                                     510
<210>72
<211>231
<212>DNA
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>72
atggcagacc gcaaacagca ccgcgctatc gcggagcgtc gtcacatcca gactgaaatc     60
aaccgcagac tttcccgcgc atcacgcgtc gcgcaaatca tgcacatcaa tatgctgcat    120
gagcgcagcc acgcactatc aaacatttat tccgcctctg ttttcagcta tctggcggat    180
gatctgcacg agtttcaaca gctcatccag cagcaaaaca aactccatta a             231
<210>73
<211>176
<212>PRT
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>73
Met Asn Val Leu Arg Ala Gln Val Ala Ser Ser Gly Arg Gly Glu Phe
1               5                   10                  15
Thr Leu Gly Asn Glu Thr Val Ser Ile Val Phe Asn Glu Thr Asp Gly
            20                  25                  30
Arg Phe Leu Ser Ser Gly Ser Ser Gly Gly Leu Leu Thr Glu Leu Phe
        35                  40                  45
Leu Tyr Gly Phe Asn Asn Gly Pro Glu Ala Leu Arg Asp Arg Met Leu
    50                  55                  60
Ser Met Leu Ser Asp Ser Gly Glu Ala Gln Ser Gln Glu Ser Ile Gln
65                  70                  75                  80
Asp Lys Ile Ser Gln Cys Lys Phe Pro Val Ser Ser Gly Asn Phe Gln
                85                  90                  95
Cys Pro Pro Glu Ser Ile Gln Cys Pro Ile Thr Leu Glu Arg Pro Glu
            100                 105                 110
Glu Gly Val Phe Val Lys Asn Ser Asp Ser Ser Ala Val Cys Cys Leu
        115                 120                 125
Phe Asp Phe Asp Ala Phe Ser Arg Leu Ala Ser Glu Gly Ser Tyr His
    130                 135                 140
Pro Leu Thr Arg Glu Pro Ile Thr Ala Ser Met Ile Ile Ser Pro Asp
145                 150                 155                 160
Lys Cys Val Tyr Asp Pro Ile Lys Gly Asn Phe Ile Ile Lys Asp Ser
                165                 170                 175
<210>74
<211>303
<212>PRT
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>74
Met Leu Ser Pro Ser Ser Ile Asn Leu Gly Cys Ser Trp Asn Ser Leu
1               5                   10                  15
Thr Arg Asn Leu Thr Ser Pro Asp Asn Arg Val Leu Ser Ser Val Arg
            20                  25                  30
Asp Ala Ala Val His Ser Asp Ser Gly Thr Gln Val Thr Val Gly Asn
        35                  40                  45
Arg Thr Tyr Arg Val Val Val Thr Asp Asn Lys Phe Cys Val Thr Arg
    50                  55                  60
Glu Ser His Ser Gly Cys Phe Thr Asn Leu Leu His Arg Leu Gly Trp
65                  70                  75                  80
Pro Lys Gly Glu Ile Ser Arg Lys Ile Glu Ala Met Leu Asn Thr Ser
                85                  90                  95
Pro Val Ser Thr Thr Ile Glu Arg Gly Ser Val His Ser Asn Arg Pro
            100                 105                 110
Asp Leu Pro Pro Val Asp Tyr Ala Gln Pro Glu Leu Pro Pro Ala Asp
        115                 120                 125
Tyr Thr Gln Ser Glu Leu Pro Arg Val Ser Asn Asn Lys Ser Pro Val
    130                 135                 140
Pro Gly Asn Val Ile Gly Lys Gly Gly Asn Ala Val Val Tyr Glu Asp
145                 150                 155                 160
Met Glu Asp Thr Thr Lys Val Leu Lys Met Phe Thr Ile Ser Gln Ser
                165                 170                 175
His Glu Glu Val Thr Ser Glu Val Arg Cys Phe Asn Gln Tyr Tyr Gly
            180                 185                 190
Ser Gly Ser Ala Glu Lys Ile Tyr Asn Asp Asn Gly Asn Val Ile Gly
        195                 200                 205
Ile Arg Met Asn Lys Ile Asn Gly Glu Ser Leu Leu Asp Ile Pro Ser
    210                 215                 220
Leu Pro Ala Gln Ala Glu Gln Ala Ile Tyr Asp Met Phe Asp Arg Leu
225                 230                 235                 240
Glu Lys Lys Gly Ile Leu Phe Val Asp Thr Thr Glu Thr Asn Val Leu
                245                 250                 255
Tyr Asp Arg Met Arg Asn Glu Phe Asn Pro Ile Asp Ile Ser Ser Tyr
            260                 265                 270
Asn Val Ser Asp Ile Ser Trp Ser Glu His Gln Val Met Gln Ser Tyr
        275                 280                 285
His Gly Gly Lys Leu Asp Leu Ile Ser Val Val Leu Ser Lys Ile
    290                 295                 300
<210>75
<211>293
<212>PRT
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>75
Met Leu Ser Pro Tyr Ser Val Asn Leu Gly Cys Ser Trp Asn Ser Leu
1               5                   10                  15
Thr Arg Asn Leu Thr Ser Pro Asp Asn Arg Val Leu Ser Ser Val Arg
            20                  25                  30
Asp Ala Ala Val His Ser Asp Asn Gly Ala Gln Val Lys Val Gly Asn
        35                  40                  45
Arg Thr Tyr Arg Val Val Ala Thr Asp Asn Lys Phe Cys Val Thr Arg
    50                  55                  60
Glu Ser His Ser Gly Cys Phe Thr Asn Leu Leu His Arg Leu Gly Trp
65                  70                  75                  80
Pro Lys Gly Glu Ile Ser Arg Lys Ile Glu Val Met Leu Asn Ala Ser
                85                  90                  95
Pro Val Ser Ala Ala Met Glu Arg Gly Ile Val His Ser Asn Arg Pro
            100                 105                 110
Asp Leu Pro Pro Val Asp Tyr Ala Pro Pro Glu Leu Pro Ser Val Asp
        115                 120                 125
Tyr Asn Arg Leu Ser Val Pro Gly Asn Val Ile Gly Lys Gly Gly Asn
    130                 135                 140
Ala Val Val Tyr Glu Asp Ala Glu Asp Ala Thr Lys Val Leu Lys Met
145                 150                 155                 160
Phe Thr Thr Ser Gln Ser Asn Glu Glu Val Thr Ser Glu Val Arg Cys
                165                 170                 175
Phe Asn Gln Tyr Tyr Gly Ala Gly Ser Ala Glu Lys Ile Tyr Gly Asn
            180                 185                 190
Asn Gly Asp Ile Ile Gly Ile Arg Met Asp Lys Ile Asn Gly Glu Ser
        195                 200                 205
Leu Leu Asn Ile Ser Ser Leu Pro Ala Gln Ala Glu His Ala Ile Tyr
    210                 215                 220
Asp Met Phe Asp Arg Leu Glu Gln Lys Gly Ile Leu Phe Val Asp Thr
225                 230                 235                 240
Thr Glu Thr Asn Val Leu Tyr Asp Arg Ala Lys Asn Glu Phe Asn Pro
                245                 250                 255
Ile Asp Ile Ser Ser Tyr Asn Val Ser Asp Arg Ser Trp Ser Glu Ser
            260                 265                 270
Gln Ile Met Gln Ser Tyr His Gly Gly Lys Gln Asp Leu Ile Ser Val
        275                 280                 285
Val Leu Ser Lys Ile
    290
<210>76
<211>50
<212>PRT
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>76
Met Val Met Pro Gly Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Thr Ser Phe Ala
1               5                   10                  15
Asn Glu Met Ala Glu Met Arg Gln Gln Val Met Glu Gly Gln Ile Gly
            20                  25                  30
Gly Phe Leu Leu Gly Gly Glu Arg Val Arg Val Ser Tyr Leu Phe Gln
        35                  40                  45
Leu His
    50
<210>77
<211>191
<212>PRT
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>77
Met Pro Leu Thr Ser Asp Ile Arg Ser His Ser Phe Asn Leu Gly Val
1               5                   10                  15
Glu Val Val Arg Ala Arg Ile Val Ala Asn Gly Arg Gly Asp Ile Thr
            20                  25                  30
Val Gly Gly Glu Thr Val Ser Ile Val Tyr Asp Ser Thr Asn Gly Arg
        35                  40                  45
Phe Ser Ser Ser Gly Gly Asn Gly Gly Leu Leu Ser Glu Leu Leu Leu
    50                  55                  60
Leu Gly Phe Asn Ser Gly Pro Arg Ala Leu Gly Glu Arg Met Leu Ser
65                  70                  75                  80
Met Leu Ser Asp Ser Gly Glu Ala Gln Ser Gln Glu Ser Ile Gln Asn
                85                  90                  95
Lys Ile Ser Gln Cys Lys Phe Ser Val Cys Pro Glu Arg Leu Gln Cys
            100                 105                 110
Pro Leu Glu Ala Ile Gln Cys Pro Ile Thr Leu Glu Gln Pro Glu Lys
        115                 120                 125
Gly Ile Phe Val Lys Asn Ser Asp Gly Ser Asp Val Cys Thr Leu Phe
    130                 135                 140
Asp Ala Ala Ala Phe Ser Arg Leu Val Gly Glu Gly Leu Pro His Pro
145                 150                 155                 160
Leu Thr Arg Glu Pro Ile Thr Ala Ser Ile Ile Val Lys His Glu Glu
                165                 170                 175
Cys Ile Tyr Asp Asp Thr Arg Gly Asn Phe Ile Ile Lys Gly Asn
            180                 185                 190
<210>78
<211>209
<212>PRT
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(147)..(147)
<223>Xaa＝any amino acid
<400>78
Met Pro Val Thr Thr Leu Ser Ile Pro Ser Ile Ser Gln Leu Ser Pro
1               5                   10                  15
Ala Arg Val Gln Ser Leu Gln Asp Ala Ala Arg Leu Glu Ser Gly Ile
            20                  25                  30
Arg Ile Ser Ile Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Val His Tyr Val Gln Leu
        35                  40                  45
Leu Asp Gly Phe Ser Val Glu Pro Val Arg Gly Gly Leu Leu Asp Arg
    50                  55                  60
Leu Leu Gly Arg Glu His Arg Met Asp Arg Arg Ala Val Ala Leu Glu
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asn Gly Gly Val Asp Phe Leu Ser Ser Val Asn Asn Tyr
                85                  90                  95
Phe Gln Ser Val Met Ala Glu His Arg Glu Asn Lys Thr Gly Asn Lys
            100                 105                 110
Ile Leu Met Glu Lys Ile Asn Ser Cys Val Phe Gly Thr Asp Ser Asn
        115                 120                 125
His Phe Ser Cys Pro Glu Ser Phe Leu Thr Cys Pro Ile Thr Leu Asp
    130                 135                 140
Thr Pro Xaa Thr Gly Val Phe Met Arg Asn Ser Arg Gly Ala Glu Ile
145                 150                 155                 160
Cys Ser Leu Tyr Asp Lys Asp Ala Leu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly
                165                 170                 175
Gly Thr His Pro Leu Ser Arg Glu Pro Ile Thr Glu Ser Met Ile Met
            180                 185                 190
Arg Lys Asp Glu Cys His Phe Asp Ala Lys Arg Glu Ala Phe Cys Cys
        195                 200                 205
Lys
<210>79
<211>213
<212>PRT
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>79
Met Pro Val Asp Leu Thr Pro Tyr Ile Leu Pro Gly Val Ser Phe Leu
1               5                   10                  15
Ser Asp Ile Pro Gln Glu Thr Leu Ser Glu Ile Arg Asn Gln Thr Ile
            20                  25                  30
Arg Gly Glu Ala Gln Val Arg Leu Gly Glu Leu Met Val Ser Ile Arg
        35                  40                  45
Pro Met Gln Val Asn Gly Tyr Phe Met Gly Ser Leu Asn Gln Asp Gly
    50                  55                  60
Leu Ser Asn Asp Asn Ile Gln Ile Gly Leu Gln Tyr Ile Glu His Ile
65                  70                  75                  80
Glu Arg Thr Leu Asn His Gly Ser Leu Thr Ser Arg Glu Val Thr Val
                85                  90                  95
Leu Arg Glu Ile Glu Met Leu Glu Asn Met Glu Leu Leu Ser Asn Tyr
            100                 105                 110
Gln Leu Glu Glu Leu Leu Asp Lys Ile Glu Val Cys Ala Phe Asn Val
        115                 120                 125
Glu His Ala Gln Leu Gln Val Pro Glu Ser Leu Arg Thr Cys Pro Val
    130                 135                 140
Thr Leu Cys Glu Pro Glu Asp Gly Val Phe Met Arg Asn Ser Met Asn
145                 150                 155                 160
Ser Asn Val Cys Met Leu Tyr Asp Lys Met Ser Leu Ile Tyr Leu Val
                165                 170                 175
Lys Thr Arg Ala Ala His Pro Leu Ser Arg Glu Ser Ile Ala Val Ser
            180                 185                 190
Met Ile Val Gly Arg Asp Asn Cys Ala Phe Asp Ser Asp Arg Gly Asn
        195                 200                 205
Phe Val Leu Lys Asn
    210
<210>80
<211>213
<212>PRT
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>80
Met Pro Val Asp Leu Thr Pro Tyr Ile Leu Pro Gly Val Ser Phe Leu
1               5                   10                  15
Ser Asp Ile Pro Gln Glu Thr Leu Ser Glu Ile Arg Asn Gln Thr Ile
            20                  25                  30
Arg Gly Glu Ala Gln Ile Arg Leu Gly Glu Leu Met Val Ser Ile Arg
        35                  40                  45
Pro Met Gln Val Asn Gly Tyr Phe Met Gly Ser Leu Asn Gln Asp Gly
    50                  55                  60
Leu Ser Asn Asp Asn Ile Gln Ile Gly Leu Gln Tyr Ile Glu His Ile
65                  70                  75                  80
Glu Arg Thr Leu Asn His Gly Ser Leu Thr Ser Arg Glu Val Thr Val
                85                  90                  95
Leu Arg Glu Ile Glu Met Leu Glu Asn Met Asp Leu Leu Ser Asn Tyr
            100                 105                 110
Gln Leu Glu Glu Leu Leu Asp Lys Ile Glu Val Cys Ala Phe Asn Val
        115                 120                 125
Glu His Ala Gln Leu Gln Val Pro Glu Ser Leu Arg Thr Cys Pro Val
    130                 135                 140
Thr Leu Cys Glu Pro Glu Asp Gly Val Phe Met Arg Asn Ser Met Asn
145                 150                 155                 160
Ser Asn Val Cys Met Leu Tyr Asp Lys Met Ala Leu Ile His Leu Val
                165                 170                 175
Lys Thr Arg Ala Ala His Pro Leu Ser Arg Glu Ser Ile Ala Val Ser
            180                 185                 190
Met Ile Val Gly Arg Asp Asn Cys Ala Phe Asp Pro Asp Arg Gly Asn
        195                 200                 205
Phe Val Leu Lys Asn
    210
<210>81
<211>209
<212>PRT
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>81
Met Pro Val Thr Thr Leu Ser Ile Pro Ser Ile Ser Gln Leu Ser Pro
1               5                   10                  15
Ala Gly Val Gln Ser Leu Gln Asp Ala Ala Arg Leu Glu Ser Gly Ile
            20                  25                  30
Arg Ile Ser Ile Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Val His Tyr Val Gln Leu
        35                  40                  45
Leu Asp Gly Phe Ser Val Glu Pro Val Arg Gly Gly Leu Leu Asp Arg
    50                  55                  60
Leu Leu Gly Arg Glu His Arg Met Glu Arg Arg Ala Val Ala Leu Glu
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asn Gly Gly Val Asp Phe Leu Ser Ser Val Asn Asn Tyr
                85                  90                  95
Phe Gln Ser Val Met Ala Glu His Arg Glu Asn Lys Thr Ser Asn Lys
            100                 105                 110
Ile Leu Met Glu Lys Ile Asn Ser Cys Leu Phe Arg Pro Asp Ser Asn
        115                 120                 125
His Phe Ser Cys Pro Glu Ser Phe Leu Thr Cys Pro Ile Thr Leu Asp
    130                 135                 140
Thr Pro Glu Thr Gly Val Phe Met Arg Asn Ser Arg Gly Ala Glu Ile
145                 150                 155                 160
Cys Ser Leu Tyr Asp Lys Asp Ala Leu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly
                165                 170                 175
Gly Ala His Pro Leu Ser Arg Glu Pro Ile Thr Glu Ser Met Ile Met
            180                 185                 190
Arg Lys Asp Glu Cys His Phe Asp Thr Lys Arg Glu Ala Phe Cys Cys
        195                 200                 205
Lys
<210>82
<211>191
<212>PRT
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>82
Met Pro Leu Thr Ser Asp Ile Arg Ser His Ser Phe Asn Leu Gly Val
1               5                   10                  15
Glu Val Val Arg Ala Arg Ile Val Ala Asn Gly Arg Gly Asp Ile Thr
            20                  25                  30
Val Gly Gly Glu Thr Val Ser Ile Val Tyr Asp Ser Thr Asn Gly Arg
        35                  40                  45
Phe Ser Ser Ser Gly Gly Asn Gly Gly Leu Leu Ser Glu Leu Leu Leu
    50                  55                  60
Leu Gly Phe Asn Ser Gly Pro Arg Ala Leu Gly Glu Arg Met Leu Ser
65                  70                  75                  80
Met Leu Ser Asp Ser Gly Glu Ala Gln Ser Gln Glu Ser Ile Gln Asn
                85                  90                  95
Lys Ile Ser Gln Cys Lys Phe Ser Val Cys Pro Glu Arg Leu Gln Cys
            100                 105                 110
Pro Leu Glu Ala Ile Gln Cys Pro Ile Thr Leu Glu Gln Pro Glu Lys
        115                 120                 125
Gly Ile Phe Val Lys Asn Ser Asp Gly Ser Asp Val Cys Thr Leu Phe
    130                 135                 140
Asp Ala Ala Ala Phe Ser Arg Leu Val Gly Glu Gly Leu Pro His Pro
145                 150                 155                 160
Leu Thr Arg Glu Pro Ile Thr Ala Ser Ile Ile Val Lys His Glu Glu
                165                 170                 175
Cys Ile Tyr Asp Asp Thr Arg Gly Asn Phe Val Ile Lys Gly Asn
            180                 185                 190
<210>83
<211>169
<212>PRT
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>83
Met Asp Ala Phe Ile Val Asp Pro Val Gln Gly Glu Leu Tyr Ser Gly
1               5                   10                  15
Leu Ser His Thr Glu Leu Ala Asp Ile Ile Arg Leu Ala Asp Ser Val
            20                  25                  30
Glu Asn Gln Leu Asn Gly Gly Asn Ser Phe Leu Asp Val Phe Ser Thr
        35                  40                  45
Tyr Met Gly Gln Val Ile Ser Glu Phe Met His Ser Asn Asp Asn Arg
    50                  55                  60
Ile Glu Leu Leu Gln Arg Arg Leu His Ser Cys Ser Phe Leu Val Asn
65                  70                  75                  80
Ile Glu Glu Met Ser Tyr Ile Asp Glu Ala Leu Gln Cys Pro Ile Thr
                85                  90                  95
Leu Ala Ile Pro Gln Arg Gly Val Phe Leu Arg Asn Ala Glu Gly Ser
            100                 105                 110
Arg Val Cys Ser Leu Tyr Asp Glu Met Ala Leu Ser Arg Ile Ile Asn
        115                 120                 125
Asp Gly Met His His Pro Leu Ser Arg Glu Pro Ile Thr Leu Ser Met
    130                 135                 140
Leu Val Ala Arg Glu Gln Cys Glu Phe Asp Cys Ser Ile Gly His Phe
145                 150                 155                 160
Thr Val Arg Ssr Asp Cys Tyr Ser Val
                165
<210>84
<211>76
<212>PRT
<213>Enterohemorrhagic E.coli
<400>84
Met Ala Asp Arg Lys Gln His Arg Ala Ile Ala Glu Arg Arg His Ile
1               5                   10                  15
Gln Thr Glu Ile Asn Arg Arg Leu Ser Arg Ala Ser Arg Val Ala Gln
            20                  25                  30
Ile Met His Ile Asn Met Leu His Glu Arg Ser His Ala Leu Ser Asn
        35                  40                  45
Ile Tyr Ser Ala Ser Val Phe Ser Tyr Leu Ala Asp Asp Leu His Glu
    50                  55                  60
Phe Gln Gln Leu Ile Gln Gln Gln Asn Lys Leu His
65                  70                  75