本发明涉及参与胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)的毒力之基因的鉴定，胸膜肺炎放线杆菌减毒突变 株的生产，以及靶向所鉴定的基因和它们产物的抗菌剂的鉴定。

胸膜肺炎放线杆菌是猪胸膜肺炎，一种接触传染性很高的猪呼吸疾 病的病原体。该病常常是致命的，结果在猪生产工业中导致严重的经济 损失。作为一种猪呼吸道的专性寄生虫，近年来胸膜肺炎放线杆菌感染 的发生率在增加，尤其是在进行集中饲养条件下的动物。细菌的传播是 通过气雾，或者通过与感染猪直接接触。

胸膜肺炎可在所有年龄的猪中发生，现在还不清楚与诱发疾病的病 毒或细菌感染的联系。胸膜肺炎放线杆菌可以是慢性的或者是急性的， 疾病的特点是逐渐严重的肺窘迫，其迅速进展到死亡，或者发展成为慢 性感染导致衰竭以至于不能健康生长。典型地观察到出血、坏死性支气 管肺炎，伴随纤维蛋白性胸膜炎。

基于它们荚膜多糖中抗原性差异以及它们的胞外毒素产物，已经鉴 定了15种不同的胸膜肺炎放线杆菌血清型。血清型1、5和7是美国胸 膜肺炎放线杆菌感染的最普通的类型，而血清型1、2、5、7和9在欧 洲占优势。

感染胸膜肺炎放线杆菌的猪的治疗通常包括直接注射抗生素(典型 地是四环素)。然而这种方法费时费力，而且昂贵，并且由于疾病的迅 速进展可能常常使用受限。然而，来自田间和实验研究的证据已经显示 胸膜肺炎放线杆菌的感染可提供抵抗随后再次感染的终生保护，因此提 示接种疫苗可能是替代抗生素治疗的可行方法。有效疫苗的开发迄今为 止一直被15种不同血清型的抗原多样性阻碍。

在生产疫苗组合物的尝试中，发现杀死的、整个细胞细菌仅提供血 清型特异性保护，但是已经显示高毒力血清型的自然感染可刺激抗多种 血清型的强烈的保护性交叉免疫[Nielsen，Nord Vet Med.31：407-13 (1979)；Nielsen，Nord Vet Med.36：221-234(1984)；Nielsen，Can J Vet Res.29：580-582(1988)；Nielsen，ACTA Vet Scand.15：80-89(1994)]。某 些未明确的活的减毒突变体也已经显示有希望用于猪的交叉保护 [Inzana等，Infect Immun.61：1682-6(1993)；Paltineanu等，In International Pig Veterinary Society，1992，p.214；Utrera等，In International Pig Veterinary Society，1992，p.213]，但是由于与包含具有 这种不明确的、自发突变的细菌株的疫苗相关的不确定性，本领域中需 要合理构建活的减毒株，其将安全地刺激针对同源物的保护性免疫，优 选异源胸膜肺炎放线杆菌血清型。也需要鉴定参与胸膜肺炎放线杆菌的 毒力的基因，以便于发展用于鉴定靶向那些基因和/或其产物的抗菌剂 的方法。

公开的国际专利申请WO 00/61724(Pharmacia & Upjohn)描述了 使用标签标记的诱变(STM)鉴定负责革兰氏阴性细菌毒力的基因。也 讨论了含有减毒细菌的疫苗的开发。在Fuller等，Microbial Pathogenesis[2000]vol.26；pp.39-51中也描述了该项工作。

在STM技术中，通过转座子整合的方法产生了许多不同的细菌株， 其中的每一个在其基因组中都携带随机突变。插入的转座子携带不同的 DNA标记标签，以便单个突变体相互之间区分。标签中的每一个都包 括可变的中央区，两侧是不变的“臂”，后者允许通过PCR扩增可变的 中央部分。在微量滴定皿中收集多个标记的突变株，然后结合起来形成 用于动物感染的“接种池”。

在感染后的适当时间，从感染动物中分离细菌，并将细菌结合起来 形成“回收池”。将回收池中的标签和接种池中的标签分开扩增、标记、 并用作探针检测排列有接种物中突变体的所有不同标签的滤膜。具有减 毒的突变株通常是不能从感染动物中回收的那些菌株，即，具有当用接 种池的标签探针检测时产生杂交信号，但是当用回收池的标签探针检测 时不产生杂交信号的标签的菌株。STM的优点是可在单个动物中针对 细菌毒力丧失同时筛选大量插入突变株。在例如WO 96/17951中更全 面地描述了STM。

在相当多的研究后，本发明的发明人提供了一种用于鉴定参与胸膜 肺炎放线杆菌毒力的基因的改良方法和手段。该方法鉴定出一个“毒力 基因”新家族，家族成员中的每一个包含选自SEQ ID NO：1-56所定 义的那些核苷酸序列中的任何一种的核苷酸序列。如这里所使用的，术 语“毒力基因”指这样的细菌基因，其正确的功能涉及，例如，是在宿主 动物中建立和/或维持感染所必需的。因此，毒力基因和它们的产物(产 物可能是多核苷酸(例如，rRNA)和/或多肽)参与细菌的致病性，但 是可能不是其体外生长必需的。

毒力基因中的突变可导致“减毒细菌”，即，与相应的相同菌株和血 清型的野生型细菌相比，其在宿主动物中建立和/或维持细菌感染的能 力降低的细菌。可通过将其给予受试动物的方法证实细菌的减毒，其中 其不能引起导致例如，可观察到的慢性感染或死亡的持续感染。猪胸膜 肺炎的症状(例如，肺窘迫、出血坏死性支气管肺炎和/或纤维蛋白性 胸膜炎)未产生也可作为细菌减毒的指标。减毒细菌在疫苗组合物中有 很重要的商业价值。

在一个方面，本发明因而提供减毒的胸膜肺炎放线杆菌细菌。

在具体的实施方案中，本发明提供在包含选自SEQ ID NO.：1-56的 核苷酸序列的基因中具有突变的减毒胸膜肺炎放线杆菌细菌。

突变可抑制或妨碍基因的功能，例如，通过降低其表达的水平(例 如，通过减少转录和/或翻译)，和/或通过削弱基因产物的生物学活性 (例如，通过导致由突变基因所编码产生的基因产物的无活性型)。基 因产物可能是多核苷酸或者多肽。

基因中的突变可以是插入、缺失或者取代。其可位于基因编码多肽 的区域，或者位于负责(或者参与)基因表达调控的序列，例如位于启 动子区。也考虑包括一个或多个插入、缺失和/或取代组合的突变。本 发明的减毒胸膜肺炎放线杆菌株同样地包括那些具有两个或多个突变 的菌株，突变中的每一个可能是插入、缺失、取代、或者其组合。多个 突变可发生在单个基因中，或者它们可发生在相同细菌基因组内的不同 基因中。它们可导致减毒水平的叠加或协同。多个突变可通过设计制备， 或者可由于引入单个突变的技术偶然产生。

缺失突变体包括那些毒力基因的全部或者部分缺失的突变。在一个 方面，突变导致缺失毒力基因的至少约10％，至少约20％，至少约30 ％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80 ％，至少约90％，至少约95％，至少约98％，或者至少约99％。缺失 可发生在SEQ ID NO.：1-56所示的适当的核苷酸序列中，或者其可发生 在基因的邻近区，例如，在相关的控制序列中。

可使用本领域技术人员公知的任何技术构建缺失突变体。一种策略 是使用可反选择的标记，并在许多不同细菌中用于缺失基因。这种技术 的细节，可参考例如Reyrat等，Infection and Immunity[1998]vol.66； pp.4011-4017，和Oswald等，FEMS Microbiol Lett[1999]vol.179； pp.153-160。

该方法使用双选择策略，其中构建编码可选择和可反选择标记两者 标记的质粒，两侧具有来自细菌基因组中期望缺失位点两侧的DNA序 列。可选择的标记用于选择其中质粒已经在适当位置和以适当方式整合 到基因组中的细菌。接着可反选择的标记用于选择比例很少的自发消除 整合质粒的细菌。那些所得细菌中的一部分将含有期望的缺失，不保留 外源DNA。

在获得缺失的另一个技术中，使用cre-lox系统用于DNA的位点特 异性重组。该系统由可被细菌cre重组酶识别的34个碱基对的lox序列 构成。如果将lox位点以适当的方向引入到基因组DNA中，可通过cre 重组酶的表达切除两侧是lox位点的序列，保留lox位点的一个拷贝。 使用标准重组技术，可能缺失胸膜肺炎放线杆菌基因组中感兴趣的序 列，并且用两侧是lox位点的可选择的标记(例如，编码卡那霉素抗性的 基因)置换。cre重组酶的瞬间表达(例如，来自含有在胸膜肺炎放线杆 菌中有功能的启动子控制下的cre基因的电穿孔的自杀(非复制)质粒) 接着将导致有效切除两侧是lox的标记。这种方法导致含有期望缺失以 及一个lox序列拷贝的细菌突变体。

在提供缺失的另一个方法中，可用标记基因缺失(置换)胸膜肺炎 放线杆菌基因组中的靶序列，例如，绿色荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖 苷酶或者荧光素酶。两侧是期望缺失的DNA片段通过PCR制备，并克 隆到用于胸膜肺炎放线杆菌的自杀载体中。然后将含有在胸膜肺炎放线 杆菌中有活性并可操作地连到合适的标记基因上的启动子的表达盒克 隆到侧翼序列之间。将质粒引入到野生型细菌中，分离整合并表达标记 基因的突变体，以及检验期望的重组事件(用标记基因置换野生型基 因)。

如对于插入突变体，这些包括其中终止密码子被插入到天然，即内 源性终止信号上游(5′)开放阅读框(ORF)内的基因。因此可通过该基因表 达(多肽)毒力基因产物的截断的、无活性型。同样地考虑使用导致移 码的插入生产无活性产物。胸膜肺炎放线杆菌的突变的毒力基因将也包 括转座子被插入到基因的蛋白编码或调控序列中的那些基因。通过STM 技术生产的减毒细菌是插入突变体，其中通过转座子序列，例如Tn10， 的插入使毒力基因无功能。

因为插入突变体(例如，通过STM产生的那些突变体)将仍然含 有细菌毒力所需遗传信息的全部，因此有它们恢复至致病状态的风险， 例如，通过插入序列的自发缺失。因此，当制备基于插入突变体，例如， 通过STM鉴定的突变体的疫苗或其它治疗性组合物时，其可能期望从 STM衍生的菌株中获得信息，即，被破坏的毒力基因的鉴定，然后重 新产生该毒力基因中的一些，大多数，或者全部被缺失的突变体。这应 当排除细菌恢复到毒力状态并因此致病而不是将其向宿主动物施用获 得预防性保护的可能性。

在相关的方面，本发明提供含有根据本发明第一方面的减毒胸膜肺 炎放线杆菌的组合物。该组合物可能是免疫原性组合物，即，一种能在 其施用的宿主动物中引起对引起抗体反应的组合物。组合物可能是治疗 性(例如，预防性)组合物。其可能是疫苗，优选一种其给予动物后赋 予保护不受随后不同于那些疫苗本身中存在的胸膜肺炎放线杆菌的血 清型和菌株感染程度(交叉保护)的疫苗。本发明进一步提供本发明第 一方面的减毒胸膜肺炎放线杆菌细菌用于生产预防或减轻动物胸膜肺 炎放线杆菌感染和/或预防或减轻与这种感染相关症状，例如，用于预 防性保护猪抗猪胸膜肺炎的药物(例如，疫苗)的用途。

为了减毒细菌在疫苗组合物中有效，毒力基因中的(一个或多个) 突变应当足够明显以防止病原体引起严重的临床症状，但是不应当显著 多以便允许在宿主动物中细菌的有限复制和生长，由此引起导致免疫学 记忆的适当的防御机制。优选毒力所必需的(明显不同于仅仅参与)基 因中的突变。

本发明的组合物可含有许多不同的减毒胸膜肺炎放线杆菌细菌，例 如，在相同的毒力基因中具有不同突变的细菌，和/或在两个或多个不 同基因中具有相似或不同突变的细菌。虽然可能单独施用本发明的无毒 力(减毒)细菌，如在本文别处讨论的，优选以含有一种或多种合适的 佐剂、稀释剂、载体、运载体和/或赋形剂的固体或液体组合物施用。 根据，以及在本发明中使用的组合物，因此可包括这些物质中的一种或 多种，其应当在与减毒细菌相容以及对免疫的动物无害的意义上是药理 学“可接受的”。另外的物质优选是无菌和无致热原。

可在本发明中使用的佐剂的实例包括基于油的佐剂，如弗氏完全佐 剂和弗氏不完全佐剂、基于霉菌酸酯的佐剂(例如，海藻糖二霉菌酸酯)、 细菌脂多糖(LPS)、肽聚糖(例如，胞壁质、粘肽、或者糖蛋白如 N-Opaca、胞壁酰二肽[MDP]、或者MDP类似物)、蛋白聚糖(例如， 那些从肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中提取的蛋白聚糖)、 链球菌制剂(例如，OK432)、Biostim TM(例如，O1K2)、EP 109 942， EP 180 564和EP 231 039的“Iscoms”、氢氧化铝、皂甙、DEAE-葡聚 糖、中性油(如miglyol)、植物油(如花生油)、脂质体、多聚醇、 Ribi氏佐剂系统(见例如，GB-A-2 189 141)以及白介素、特别是那些 刺激细胞介导的免疫佐剂。已经描述了由放线菌目中的一个细菌属，无 枝酸菌目(Amycolata)的提取物构成的佐剂(U.S.4,877,612)。佐剂混 合物都可商业获得。使用的佐剂将取决于，至少部分取决于受体动物。 施用佐剂的量也将取决于动物的种类和大小。可以很容易地通过本领域 技术人员公知的常规方法确定最佳剂量。

对于任何稀释剂、载体、运载体和/或赋形剂，那些物质性质上可 以是液体、半固体、或者固体。可使用本领域技术人员已知的任何适当 的物质。示范性的物质包括聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯、硬脂酸镁、 甲基和丙基羟基苯甲酸酯(propylhydroxybenzoate)、滑石粉、藻酸盐、 淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、甘露醇、阿拉伯胶、磷酸钙、 矿物油、可可脂以及可可油。

本发明的组合物可包装成便于或者适合具体给药途径的各种形式。 治疗性组合物(例如，疫苗)可适于通过例如静脉内、真皮内、肌肉内、 乳房内、腹膜内和/或皮下注射，和/或通过口服、舌下、鼻、肛门或阴 道输送施用给受试动物。治疗可由单剂量或者由在一段时间中多剂量构 成。对给药方案的决定在本领域技术人员的范围内是公知的。组合物可 配制和包装成适当的形式。

在另一个方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，其编码参与胸膜 肺炎放线杆菌的毒力(例如，必需的)的基因产物。该多核苷酸的序列 因此发现于胸膜肺炎放线杆菌的毒力基因中。本发明也提供编码基因产 物的多核苷酸，其不是在胸膜肺炎放线杆菌中天然发现的，但是其表达 能够调节(例如，降低)该细菌的毒力。可将这种多核苷酸引入到细菌 中产生这种表达(例如，通过转化、转染或者电穿孔)。表达可产生细 菌的减毒株，例如用于疫苗或者其它免疫原性组合物。也考虑不是在胸 膜肺炎放线杆菌中天然发现的，但是其能够通过它们与胸膜肺炎放线杆 菌毒力基因或者基因产物的直接相互作用(而不是由它们自己的基因产 物通过间接作用)调节该细菌毒力的多核苷酸。

根据本发明的多核苷酸的任何基因产物可以是多核苷酸(例如， RNA)或者多肽。多肽基因产物这里称作“毒力多肽”，参与/能够调节 胸膜肺炎放线杆菌的毒力，无论它们是否由野生型细菌基因组天然编 码。可影响胸膜肺炎放线杆菌毒力的多核苷酸基因产物包括例如，反义 RNA和核酶。可通过测定对表达能在动物中建立和/或维持感染的产物 的胸膜肺炎放线杆菌菌株的影响程度与不表达该产物的相同株和血清 型的胸膜肺炎放线杆菌比较，证明任何基因产物对细菌毒力的影响。

根据这个方面，本发明更具体地提供分离的多核苷酸，包括(例如， 由下列序列构成)：(a)选自SEQ ID NO.：1-56的核苷酸序列(这些 序列是如本文别处鉴定的胸膜肺炎放线杆菌的毒力基因内发现的)；(b) 编码由(a)中所述的核苷酸序列所编码的多肽的核苷酸序列；(c)在 中等至高度严格条件下，与(a)和/或(b)的核苷酸序列，或与其互 补链杂交的核苷酸序列；或者(d)(a)-(c)的核苷酸序列中的任 何一种的片段，其片段保留(a)-(c)所述的核苷酸序列的免疫学性 质和/或生物学活性。本发明的多核苷酸可以是DNA或者是RNA，如 本文别处所描述的。

一旦从(a)的核苷酸序列中获得氨基酸序列，可以很容易地鉴定 (b)型核苷酸序列，并且列出遗传密码。

至于(c)，示范性的中等严格条件包括在35℃到45℃，在包含 2xSSC/0.1％SDS的缓冲液中的最后冲洗。示范性的高度严格条件包括 在65℃到75℃，在包含2xSSC/0.1％SDS的缓冲液中的最后冲洗。应 当理解的是在本领域中，可通过改变温度和缓冲液或者盐浓度的方法获 得同等严格的条件。在这点上，可参考Ausubel等，Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons(1994)，pp.6.0.3 to 6.4.10。杂交条 件的修改可根据经验决定或者基于鸟苷/胞嘧啶(GC)碱基对的长度和 百分率精确计算。可根据Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，New York(1989)，pp.9.47 to 9.51描述的方法计算杂交 条件。

对于(d)型的片段，根据(a)，(b)或者(c)的核苷酸序列的 知识，技术人员能够得到该核苷酸序列的每个可能的片段。片段可以是 至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35 个、至少40个、至少45个、或者至少50个核苷酸长。它们可以在中 等到高度严格条件下能与(a)、(b)或(c)的核苷酸序列，或者与 其互补序列杂交，可选择地在存在竞争性核酸时，例如，在存在来源于 胸膜肺炎放线杆菌的cDNA或mRNA文库的核酸时。保留的免疫学性 质可能是该片段能够被特异性结合全长核苷酸序列的抗体特异性结合。 构思了至少107M-1的结合亲和力。片段保留的生物学活性可以是能够 编码与全长核苷酸序列所编码的多肽具有相同结合能力的多肽，例如能 够结合到其在体内天然结合配体中的一种，或者相同抗体。

由于对于本领域技术人员将很显而易见，胸膜肺炎放线杆菌毒力基 因的鉴定能够鉴定其它相关细菌，例如，巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae) 的其它成员中的相应(即，同源)基因。以分离的形式，这种基因序列 可能包括在所要求的包含根据上述(c)型核苷酸序列(或者由其构成) 的多核苷酸内。使用(a)型核苷酸序列(或其片段)作为探针的Southern 杂交可鉴定其它细菌的基因组、cDNA或者mRNA文库中这种相关序 列。另外，使用PCR，使用包含胸膜肺炎放线杆菌序列或其片段的引 物，可以跨过物种分界线同样有效地鉴定毒力基因。作为另一种可供选 择的方法(其不依赖杂交但是仍然能鉴定同源基因)，可使用胸膜肺炎 放线杆菌突变体株与其它物种的多核苷酸(例如，DNA或mRNA)文 库的互补来鉴定具有相同，或者相关生物活性的基因。总之，本发明的 多核苷酸，其包含根据(c)型的核苷酸序列，可能发现位于，或者构 成与胸膜肺炎放线杆菌相关的其它细菌的毒力基因。

相关毒力基因的鉴定可通过该基因的突变导致产生其它生物的减 毒株，以及可能因此用于生产疫苗和其它免疫学组合物。在另一个方面， 本发明因此提供：(1)在包括在中等到高度严格条件下，能与SEQ ID NO：1-56所定义的核苷酸序列中的任何一种杂交的核苷酸序列的基因中 含有突变的减毒细菌(例如，巴斯德氏菌科的细菌)；(2)含有这种 细菌的组合物(例如，疫苗)；以及(3)这种细菌用于生产治疗性治 疗或预防性保护动物避免相应野生型细菌(或者不同的菌株或其血清 型)感染的药物(例如，疫苗)的用途。

如本文别处所解释的，(a)-(d)型的本发明的多核苷酸可以是 例如，DNA、RNA、或者肽核酸，根据例如在Corey，TIBTECH 15： 224-229(1997)中所描述的。DNA序列包括来源于(提取或者扩增的) 基因组DNA，或者cDNA，以及完全地或者部分化学合成的核苷酸序列 的那些DNA序列。可通过本领域技术人员公知的任何方法完成扩增， 例如，通过PCR。

与生产多核苷酸的酶促(例如基于PCR)方法相对，这里使用的“化 学合成”指纯粹地化学方法。“完全地”合成的多核苷酸是完全通过化学 方法生产的那些多核苷酸，“部分地”合成的多核苷酸包括那些其中仅部 分所得的序列是通过化学方法生产的。

本发明的多核苷酸，或者它们的基因产物，可以是核酶。这种多核 苷酸可能包括或者由根据上述(c)型的(RNA)核苷酸序列构成，即一种 能够与(a)或(b)中所述核苷酸序列中的任何一种在中等到高度严格 条件下杂交的多核苷酸。对于核酶技术的回顾，参考Gibson和Shillitoe， Mo1.Biotech.7：125137(1997)。可利用核酶以序列特异性方式抑制 mRNA的翻译(例如从毒力基因中转录的mRNA)，例如，通过：(i) 核酶的互补RNA序列与靶mRNA的杂交；以及(ii)通过核酶固有的 核酸酶活性切割杂交的靶mRNA。本发明的多核苷酸因此可用于抑制胸 膜肺炎放线杆菌或者其它相关细菌，例如巴斯德氏菌属细菌的毒力基因 的表达。核酶可通过根据经验的方法鉴定，但是它们可能不是基于靶 mRNA上的可及位点特异性设计，例如，基于SEQ ID NO：1-56所定义 的核苷酸序列的mRNA转录产物(也见Bramlage等，Trends in Biotech 16：434-438(1998))。

为了控制mRNA翻译，可使用本领域技术人员公知的输送技术靶 细胞输送核酶。外源性输送方法可包括使用靶向脂质体或者直接局部注 射。内源性方法包括使用病毒载体和使用非病毒质粒。

本发明的某种多核苷酸也可用于调节胸膜肺炎放线杆菌中毒力基 因的转录，例如，通过寡核苷酸指导的三螺旋结构形成的方法。对于这 种技术的回顾，参考Lavrovsky等，Biochem.Mol.Med.62：11-22 (1997)。使用在主沟(根据在Watson-Crick模型中所定义的)与双链 DNA杂交的序列特异性寡核苷酸完成三螺旋结构形成。这种序列特异 性寡核苷酸的杂交可在此后调节DNA-结合蛋白，包括例如，转录因 子和聚合酶的活性。优选的用于杂交的靶序列包括调节毒力基因表达的 转录调节区。能够形成三螺旋的寡核苷酸也用于毒力基因中靶DNA序 列的位点专一的共价修饰。根据例如Lavrovsky等，Biochem.Mol.Med. 62：11-22(1997)中所描述的方法将用于共价修饰的寡核苷酸偶联到 DNA破坏剂上。

在另一个方面，本发明提供了包含根据本发明的多核苷酸的载体。 载体性质上可以是DNA或RNA。为了在合适的宿主细胞中在适当的条 件下，促进其转录，以及可选择地能使其翻译，其可含有可操作地连到 多核苷酸上的一个或多个调控序列。载体可以是质粒，或者病毒载体。 它们可能能够自主复制。调控序列可以是内源的(即，在本发明的多核 苷酸来源的野生型细菌内发现的，例如胸膜肺炎放线杆菌)或者它们可 以是外源的(例如，在相关的细菌中，例如在巴斯德氏菌科的另一个成 员中发现的调控序列)。调控序列尤其包括启动子和转录终止子。

进一步构思了含有(例如，转化、转染、或者电穿孔)本发明的多 核苷酸或载体的宿主细胞。这种宿主细胞是以允许多核苷酸的转录，以 及可选择地使所得mRNA翻译的方式，用本发明的多核苷酸或载体稳 定地或瞬时转化、转染、或者电穿孔的原核细胞或者真核细胞。本发明 的宿主细胞包括细菌、酵母、真菌、无脊椎动物以及哺乳动物细胞。也 考虑含有本发明的多核苷酸或载体的病毒。

本发明的宿主细胞可用于大规模生产毒力多肽(其中本发明的多核 苷酸编码多肽序列)的方法。在有利的条件下在适当的培养基中培养细 胞，通过本领域技术人员公知的任何纯化技术，例如，通过亲合柱上的 捕获，从细胞中或者从细胞生长的培养基中分离期望的多肽。这种细胞 可以是用于发展特异性结合毒力多肽的抗体的免疫原的有价值的来源。 可使用任何合适的宿主细胞用于表达根据本发明的多核苷酸。

对于这种和其它目的，可使用在本领域技术人员的范围内公知的标 准技术操作本发明的多核苷酸，例如，在Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press： Cold Spring Harbor，New York(1989)中所描述的技术。通过举例的方 式，通过例如，PCR，例如，使用基因组DNA、cDNA或mRNA作为 模板，可扩增和克隆本发明的多核苷酸。为了容易地将克隆的序列插入 到载体中，例如表达载体，可选择PCR引物使得PCR扩增的序列在起 始密码子ATG前的5’端具有限制性酶切位点，以及在终止密码子TAG、 TGA、或TAA后的3’端有限制性酶切位点。根据Grosjean和Fiers， Guide，18：199-209(1982)以及Konigsberg和Godson，Proc.Natl.Acad. Sci.(USA)，80：687-691(1983)所描述的方法，如果需要的话，根据想要 转化宿主细胞例如大肠杆菌(E.coli)的优选密码子，可改变克隆序列 中的密码子，而不改变氨基酸。当在该宿主中生产时，密码子使用的最 优化可导致基因产物的表达增加。

如果在细胞外生产毒力多肽，例如，在宿主细菌的周质中，或者在 宿主细胞周围的培养基中，那么可克隆无其起始密码子的本发明的多核 苷酸，并在适当的信号序列后将其置于表达载体中。已知许多原核生物 和真核生物的信号序列在重组蛋白的分泌中起作用。在蛋白分泌过程期 间，可通过信号肽酶除去信号肽，产生成熟蛋白。

为了简化毒力多肽的纯化，可将纯化标签添加到多肽编码序列的5′ 和/或3′端。通常使用的纯化标签包括六组氨酸残基的一段序列(美国 专利Nos.5,284,933和5,310,663)、Schmidt和Skerra，Protein Engineering，6：109-122(1993)所描述的链霉抗生物素-亲和性标签、 FLAG肽(Hopp等，Biotechnology，6：12051210(1988))、谷胱甘肽S-转 移酶(Smith和Johnson，Gene，67：31-40(1988))、以及硫氧还蛋白 (La Vallie等，BiolTechnology，11：187-193(1993))。为了除去这些标 签，可在融合接点插入蛋白酶剪切识别位点。通常使用的蛋白酶是Xa 因子、凝血酶以及肠激酶。

在另一个方面，本发明提供生产本发明的多核苷酸编码的毒力多肽 的方法。该方法可包括下列步骤：(i)在允许多肽表达的条件下培养 根据本发明的宿主细胞；以及(ii)从宿主细胞或者从其周围的培养基 中回收并且可选择地分离所表达的多肽。本发明的多核苷酸的鉴定很容 易获得它们所编码的多肽，因此这些多肽可选择地用化学方法合成。

本发明的多核苷酸所编码的多肽(和这种多肽的变体)是本发明的 另一方面。这种多肽是如本文别处所讨论的“毒力多肽”。进一步考虑含 有这种多肽的组合物，这些包括疫苗和其它免疫原性组合物。这种组合 物可含有如本文别处所讨论的一种或多种佐剂、载体、稀释剂、运载体 或者赋形剂。

变体包括本发明的多核苷酸编码的多肽的生物学和/或免疫学活性 片段，例如，在SEQ ID NO.：1-56中任何一种所定义的多核苷酸序列所 编码的多肽的片段、多肽或其片段与例如，异源多肽的融合(因此生产 嵌合体)、以及多肽的类似物，例如，其中缺失、取代或添加一个或多 个氨基酸的多肽：(i)不丧失一种或多种对多肽特异的生物学活性和/ 或免疫学特性；或者(ii)特异性失去多肽的特定生物学活性。可使用 保守的氨基酸进行置换。

考虑在-1位置上有额外蛋氨酸残基的毒力多肽，以及在-2和-1 位置上有额外甲硫氨酸和赖氨酸残基的毒力多肽。这些类型的变体在细 菌细胞类型中对于重组蛋白生产特别有用。本发明也包含使用特殊表达 系统产生具有额外氨基酸残基的变体。例如，使用表达期望多肽为与谷 胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白的商业可获得的载体，提供从期 望多肽上切除GST元件后在-1位置上具有额外甘氨酸残基的期望多 肽。本发明的多肽的变体也包括已经除去前导或信号序列的那些变体， 例如，成熟形式。

变体多肽包括与SEQ ID NO.：1-56中的任何一个所定义的核苷酸序 列编码的毒力多肽具有至少约99％、至少约95％、至少约90％、至少 约85％、至少约80％、至少约75％、至少约70％、至少约65％、至少 约60％、至少约55％、以及至少约50％序列同一性和/或同源性的那些 变体多肽。这里将氨基酸序列的“同一性”百分率定义为将序列和引入的 缺口进行序列比对之后，候选序列中与毒力多肽中的残基完全相同的氨 基酸残基的百分率，如果必要的话，获得最高序列同一性百分率，不考 虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。关于SEQ ID NO：1-56中任 何一个所编码的毒力多肽的氨基酸序列的“同源性”百分率是指将两个 序列和引入的缺口序列比对之后，候选序列中与毒力多肽的残基完全相 同的氨基酸残基的百分率，如果必要的话，获得最高序列同一性百分率， 也考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。

保守取代意味着用一个氨基酸交换相同类型的氨基酸，类型如下：

脂肪族非极性：   GAPILV

极性-不带电硫：  CM

极性-不带电羟基：ST

极性-带电酸性：  DENQ

极性-带电碱性：  KRH

芳香族：         FWY

在另一个方面，本发明扩展到特异性识别本发明的多核苷酸或多肽 的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆抗体。它们包括嵌合抗体，例如人 源化的抗体，例如互补决定区(CDR)-移植抗体，以及抗体(其可以 是嵌合的)的片段，例如Fab，F(ab’)2，Fd和单链抗体。它们也包括具 有CDR序列特异性识别本发明的多核苷酸或多肽的化合物。本发明也 提供特异性结合本发明的抗体的抗独特型抗体。

术语“特异性”表示本发明抗体的可变区仅识别靶多肽或多核苷酸 (即，它们能够从相关的多肽或多核苷酸中区别单一多肽或者多核苷 酸)。考虑至少约107M-1，至少约108M-1，或者至少约109M-1的结合亲 和力。那并不是说，抗体将不与其它蛋白(例如，金黄色葡萄球菌(S. aureus)蛋白A或者在ELISA技术中的其它抗体)通过与在抗体可变 区外面的序列，特别的，在分子的恒定区中的相互作用而相互作用。筛 选试验以确定本发明抗体的结合特异性是本领域技术人员公知的和常 规实践的方法。为了全面讨论这种试验，可参考Harlow等.(编辑)， Antibodies.A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory； Cold Spring Harbor，NY(1988)，Chapter6。

根据本发明的另一个方面，提供用于鉴定能够调节本发明鉴定的胸 膜肺炎放线杆菌毒力基因、或者相关物种中同源基因功能的抗菌剂的材 料和方法。同样考虑能够调节这种毒力基因功能的药剂本身。更具体地， 本发明的方法包括筛选能够干扰宿主细菌中SEQ ID NO：.1-56中任何一 个所示核苷酸序列所编码的基因产物的表达和/或生物活性的潜在药 剂。干扰毒力基因产物表达的药剂包括(但不限于)含有与SEQ ID NO：.1-56的核苷酸序列中的任何一个同源的核苷酸序列的反义多核苷 酸和核酶(它们结合其互补链)。本发明进一步包括通过使用寡核苷酸 指导的三螺旋形成调节这种毒力基因转录的方法。

除了通过给予这种抗菌剂或组合物治疗患巴斯德氏菌属(例如胸膜 肺炎放线杆菌)感染的动物的方法，含有根据本发明鉴定的抗菌剂的组 合物是本发明的另一方面。本发明也包含这种药剂或组合物用于生产治 疗巴斯德氏菌属感染，例如胸膜肺炎放线杆菌感染和/或猪胸膜肺炎的 药物的用途。

干扰毒力基因功能的药剂包括：(i)可与野生型产物竞争其生理 学结合位点的毒力基因产物的非功能性变体；以及(ii)毒力基因产物 的结合配偶体，其螯合和任选地破坏所述产物。药剂也包括变构酶抑制 剂，在毒力基因产物是酶时。

可通过使用本发明的多核苷酸或它们所编码的产物(其可能是RNA 多核苷酸或者多肽)的高通量筛选试验的方法鉴定抑制剂。建立基于活 性以及筛选能调节(例如，抑制)该活性的潜在药剂的试验，其中筛选 使用具有酶促活性的多肽基因产物。对于通过与多肽或多核苷酸相互作 用发挥它们功能的毒力基因产物，建立结合试验以测量这种相互作用， 以及筛选能够调节，例如抑制该相互作用的潜在的试剂。

在结合试验的一个实施方案中，毒力基因产物固定在固体支持物 上，在存在和缺乏推定的抑制剂化合物时，评定与(生理学的)结合配 偶体的相互作用。在另一个实施例中，在存在和缺乏推定的抑制剂化合 物时，在溶液鉴定中评定毒力基因产物和其结合配偶体之间的相互作 用。在两个试验中，抑制剂被鉴定为降低毒力基因产物和其结合配偶体 之间结合的化合物。当毒力基因产物和其结合配偶体都是多肽时，使用 的试验包括双杂交试验的变通方式，其中根据例如在公开的国际专利申 请WO 95/20652中所描述的方法，通过检测转化或转染的宿主细胞中 的阳性信号鉴定蛋白/蛋白相互作用的抑制剂。

考虑的在本发明的方法中使用的候选抑制剂包括选自潜在抑制剂 文库中的化合物。可使用许多不同文库作为小分子调节剂的来源，包括： (1)化学文库；(2)天然产物文库；以及(3)由随机肽、寡核苷酸 或者有机分子构成的组合文库。

化学文库由已知化合物的结构类似物构成。天然产物文库是用于产 生所筛选混合物的微生物、动物、植物、或者海洋微生物的集合，其中 混合物通过下列步骤进行筛选：(i)土壤、植物或者海洋微生物的肉 汤培养基的发酵和提取；或者(ii)植物或海洋微生物的提取。天然产 物文库在例如Science 282：63-68(1998)中进一步讨论。对于组合物文 库，这些文库由大量肽、寡核苷酸、或者有机化合物作为混合物组成。 它们相对容易通过传统的自动合成方法、PCR、克隆、或者专有合成方 法制备。特别感兴趣的是肽和寡核苷酸组合文库。对于组合化学文库的 回顾，可参考Myers，Curr.Opin.Biotechnol.8：701-707(1997)。

可特异性设计考虑在本发明的方法中使用的其它候选抑制剂。这些 包括毒力多肽的可溶形式的结合配偶体。如这里使用的术语“结合配偶 体”包含包括片段和其衍生物的抗体(尽管在某些实施方案中它们被除 外)，以及包括特异性结合靶基因产物的抗体结构域的修饰的化合物。

当毒力基因产物的多肽结合配偶体不是已知的时，可使用鉴定生理 学，或者非生理学的以及因此螯合结合配偶体的试验，例如，使用其上 固定毒力基因产物的亲和柱的试验。可选择地，可使用根据在Fields和 Song，Nature，340：245-246(1989)，以及Fields和Sternglanz，Trends in Genetics，10：286-292(1994)中所描述的酵母双杂交系统鉴定多肽之 间的结合相互作用。其它可用于搜寻结合多肽毒力基因产物的试剂的试 验包括在美国专利No.5,585,277中所描述的试验，其依靠蛋白通常以折 叠和未折叠状态的混合物存在并且在这两个状态之间不断交替的原理。 当试验配体结合到折叠形式的靶毒力多肽时，被配体结合的靶蛋白分子 保持其折叠状态。因此，在存在结合靶蛋白的试验配体时，呈现出比缺 乏配体时更高程度的折叠的靶蛋白。可通过区分靶蛋白的折叠和非折叠 状态的任何方法测定配体对靶蛋白的结合。为了进行这种试验不必知道 靶蛋白的功能。事实上可通过这种方法评估任何试剂作为试验配体，包 括，但不限于金属、多肽，包括蛋白质，脂类，多糖，多核苷酸和有机 小分子。

在Wieboldt等，Anal.Chem.，69：1683-1691(1997)中描述了鉴定毒 力基因多肽配体的另一个方法。该技术在溶液相中每次筛选结合靶毒力 多肽的20到30个试剂的组合文库。通过离心超滤将结合靶的试剂与其 它较小的文库组分分离。随后将在滤器上保留的特异性选择的分子从靶 蛋白中释放，并且通过，例如HPLC和充气促进的电喷射(离子喷射) 离子化MS进行分析。这种方法选择对靶蛋白具有最高亲和力的文库组 分，对小分子文库特别有用。

通过最初筛选鉴定的结合试剂也可评估它们在体内对毒力的影响。 妨碍细菌毒力的药剂可预防产生感染，或者一旦产生感染逆转感染的结 果。根据这里别处所描述的，结合试剂可包含在含有药学上可接受的佐 剂、赋形剂、稀释剂、载体或运载体的组合物中。

一旦考虑其中描述了目前所准备的其实施方案的本发明的下列详 细描述，本发明的许多另外的方面和优点现在对于本领域技术人员将是 显而易见的。

实施例1

A. 材料和方法

1.细菌菌株和生长条件

使用常规方法选择毒性胸膜肺炎放线杆菌血清型1菌株4074的自 发抗萘啶酮酸的衍生物，称作4074NalR。通过在猪中传代验证这种菌 株的毒力。在37℃、5％CO2的在补充了10％Levinthal氏碱(BHIL)的 脑心浸液(BHI)平板上，或者在37℃，在含有5μg/mlβ-烟酰胺嘌呤 二核苷酸(NAD)和11mM氯化钙的Colombia肉汤培养基中繁殖胸膜肺 炎放线杆菌株。

在本研究中使用的大肠杆菌(E.coil)株是：在Miller和Mekalanos (1988)J.Bacteriol.170，pp.2575-2583中描述的S17λpir[用λpir噬菌 体溶原化的recA thi pro hsdR-M+RP4∷2-Tc∷Mu∷Km Tn 7]；根据在de Lorenzo等，(1990)J.Bacteriol.172，pp.6657-6667中所描述的CC118λ pir[用λpir噬菌体溶原化的Δ(are-leu)araD ΔlacX74 galE galK pho A20 thi-1 rpsE rpoB argE recA1]；以及XL1-Blue(recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F′proAB laclq ZΔM15 Tn10(Tetr)])。在含有 适当抗生素的Luria-Bertani(LB)培养基中维持大肠杆菌株，其中抗生 素使用下列浓度：氨苄青霉素100μg/ml；卡那霉素100μg/ml；萘啶酮 酸20μg/ml；四环素10μg/ml。

2.DNA操作、扩增、标记、以及标签的杂交

根据生产商的使用说明，使用QIAamp mini DNA试剂盒(Qiagen) 从胸膜肺炎放线杆菌中分离染色体DNA。再次根据生产商的使用说明， 使用Qiagen质粒midi试剂盒从大肠杆菌(E.coil)中分离质粒DNA。 根据Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，New York(1989) 中所描述的标准技术进行DNA操作。根据生产商所描述的方法，使用 PCR DIG探针合成试剂盒(Roche)用[地高辛(DIG)-11]-dUTP标记DNA 印迹的探针。根据在Hensel等(1995)Science 269 pp.400-403中所描述 的方法进行DNA标记-标签的扩增和标记。使用下列引物通过PCR方 法从基因组DNA中开始扩增标签：

P6(5′-CGACTACAACCTCAAGCT-3′)

P7(5′-CGACCATTCTAACCAAGC-3′)

扩增的标签在2％Nusieve GTG琼脂糖凝胶上纯化并在再次使用P6 和P7的第二次PCR中用[32P]-dCTP进行放射性标记。两次PCR的循 环条件如下：在95℃变性和酶活化12分钟，随后进行20个循环：95℃ 30秒，50℃ 45秒以及72℃ 10秒。使用1单位AmpliTaq Gold (Perkin-Elmer)聚合酶在Perkin-Elmer 2400热循环仪中进行反应。使用 前，通过用HindIII在37℃消化18小时从可变的标记-标签中分离恒 定的侧翼DNA。

对于集落印迹，使含有pLOF/TAG 1-48质粒中的每一个的大肠杆 菌(E.coli)S17λpir株长到指数期的中期，将每种培养物的100μl培 养物转移到微量滴定皿的孔中。使用复制平板器(Sigma)将细菌从微 量滴定皿中转移到尼龙膜(Hybond N)上，并将接种的膜置于干燥的 含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板的表面。37℃过夜生长后， 将膜用1.5M NaCl，0.5M NaOH处理10分钟。通过微波在最大功率处 理30秒钟，将DNA固定到膜上，通过在2XSSC中洗涤除去细菌碎屑。 在65℃ Rapid-hyb缓冲液(Amersham)中分别进行1小时预杂交和过夜 杂交。根据标准方法洗涤印迹。为了鉴定潜在的减毒突变体，将从输入 池(接种物)中制备的用标记的标签所探测的印迹上的杂交信号和与从 至少两个不同动物的相应输出池中制备的标记标签杂交的完全相同的 印迹进行比较。

3.DNA标记-标签和pLOF/TAG1-48的构建

通过可变的寡核苷酸池RT1的PCR扩增获得双链DNA标记标签 (Hensel等，1995 Science 269 pp.400-403)，使用下列引物：

P3SAL(5′-CGCCATGTCGACCATTCTAACCAAGCTT-3′)

P5SAL(5′-CGCCTAGTCGACTACAACCTCAAGCTT-3′)

其中的每一种在其5’末端含有限制性内切酶SalI识别位点。为了 便于标记-标签在质粒pLOF/Km中的克隆，对质粒进行修饰以掺入唯 一的SalI位点。这通过将下列互补寡核苷酸退火完成：

SALTOP(5′-GTCGACCCT-3′)和

SALBTM(5′-GTCGACAGG-3′)

产生含有两侧是SfiI-相容端的SalI位点的双链接头。质粒 pLOF/Km用SfiI消化，用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)处理，并连接到磷 酸化的双链接头上产生质粒pLOF/Sal。PCR扩增的双链DNA标记标 签用SalI消化，凝胶纯化，并且克隆到SalI消化的，CIAP处理的 pLOF/Sal上产生独特标记的pLOF/TAG质粒文库。

通过菌落印迹与它们相应的[32P]-dCTP标记的标签杂交，筛选大肠 杆菌株CC118λpir中的单个转化体，鉴定高效扩增和标记的100个标 签。然后检验这些标签是否缺乏交叉杂交，选择48个质粒 (pLOF/TAG1-48)进一步使用。

4.标签-标记的突变体库的构建

将在质粒pLOF/TAG 1-48上携带的48个标签-标记的mini-Tn10 转座子通过接合各自引入到胸膜肺炎放线杆菌中。使胸膜肺炎放线杆菌 4074NalR株和含有pLOF/TAG 1-48质粒中的每一种的大肠杆菌S17λ pir在37℃过夜生长到生长静止期。通过3,000rpm离心15分钟收获 细菌，并用10mM MgSO4洗涤两次。将大约相同数量的胸膜肺炎放线 杆菌受体和大肠杆菌供体细胞混合，浓缩，并铺到0.22μM滤器上。将 滤器置于含有1mM IPTG的BHIL平板上，在37℃，5％CO2孵育5 小时。其后，将细菌移到5ml无菌PBS中，将等分试样铺于补充了萘 啶酮酸(20μg/ml)和卡那霉素(100μg/ml)的BHIL平板上。对48个标签- 标记的微型Tn10转座子中的每一个进行4个单独的接合。对转接合子 突变体进行氨苄青霉素敏感性筛选，因此除去携带插入到染色体中的自 杀载体的共合体的菌株。从48个单个接合中分离总共2064个转座子突 变体，并将它们安排到43个池中，每个池中48个突变体。将突变体装 于含有15％甘油的1.5ml冷冻管中-80℃贮藏。

5.感染研究

将每个池中的48个胸膜肺炎放线杆菌标签标记的突变体中的单个 菌株各自培养到生长对数期中期。在OD600大约0.3时，将单个突变体 菌株组合起来，在HEPES中将汇集的培养物稀释到大约2×106cfu/ml。 向6到10周龄以及通过细菌学和血清学分析确定无胸膜肺炎放线杆菌 的大白十字(Large White Cross)小猪，气管内接种3ml稀释培养物。 将接种物的连续稀释液铺在选择性BHIL后，通过活菌计数核实接种物 中的cfu的数量。使用每个突变体池感染至少两个动物。

在感染后大约24小时，无痛处死存活的动物并分离肺。通过：(i) 用Hanks缓冲盐溶液(HBSS)充分灌洗；或者(ii)在500ml HBSS 中将肺匀浆，从感染的肺中回收存活的细菌。将细菌悬液的等分试样铺 于选择性培养基上，接着在7℃，5％CO2，过夜生长，汇集大约10,000 个菌落(“输出池”)，制备全部染色体DNA。

6.竞争指数

为了测定单个STM突变体的体内竞争性指数(CI)，使突变体和野 生型细菌在含有5μg/ml NAD和11mM CaCl2的Colombia肉汤培养基 中生长到OD600为0.3。然后将培养物组合起来产生相等数量的突变体 和野生型微生物，稀释到2×106cfu/ml，并且气管内接种到至少两个动 物中。将接种物的连续稀释液平行铺于BHIL+20μg/ml萘啶酮酸(突变 体和野生型)，以及BHIL+20μg/ml萘啶酮酸+100μg/ml卡那霉素(仅 是突变体)后，通过活菌计数核实接种物中突变体与野生型的比例。感 染后大约24小时，无痛处死存活的动物并分离肺。将肺在500ml HBSS 中匀浆，将等分试样铺于选择性培养基(见上面所述)上以回收存活的细 菌。根据突变体对野生型微生物的输出率除以突变体对野生型微生物的 输入率，计算体内CI。为了测定体外CI，使突变体和野生型微生物生 长到指数期中期，以相等数量混合，在37℃再振荡培养联合培养物3 小时。在固定间隔采集样本，稀释，并同前面一样铺于选择性BHIL上， 根据上面描述的方法计算体外CI。

7.毒力基因鉴定和DNA测序

为了鉴定体内减弱的损害，通过反向PCR克隆或扩增转座子插入 位点两侧的DNA。对于克隆，用一组限制性酶消化染色体DNA，通过 琼脂糖凝胶电泳分离，转移到尼龙膜上，在DNA印迹中用DIG标记的 对Tn10卡那霉素基因特异的探针探测。从凝胶中切下与探针杂交的适 当大小的片段，纯化并克隆到适当消化的pBR322中。在含有100μg/ml 卡那霉素的LB琼脂上选择大肠杆菌株XL1-Blue中的转化体。

为了便于测序，使用Tn10特异性寡核苷酸引物：

BS401(5′-GACAAGATGTGTATCCACC-3′)

将克隆的插入片段进一步亚克隆到质粒pBCKS(Stratagene)中。根 据在Fuller，(2000)Microb.Pathog.29，pp.25-38中所描述的方法进行转 座子插入位点两侧DNA的反向PCR扩增，用SspI(其在转座子中一次 切割)消化染色体DNA，稀释到150ng/ml，使用快速DNA连接试剂 盒(Roche)自我连接15分钟。然后使用引物对BS401+TEF48，以及 BS401+TEF62扩增连接的DNA(Fuller，2000 Microb.Pathog.29， pp.25-38)。反向PCR的反应条件同以前所描述的一样(Fuller，2000 Microb.Pathog.29，pp.25-38)。琼脂糖凝胶电泳后，使用QIAQUICK凝 胶提取试剂盒(Qiagen)纯化得到的扩增子。使用BigDye终止子循环测 序试剂盒(Perkin-Elmer)进行DNA测序反应。使用相似搜索程序的 BLAST设置，用减毒突变体中的每个序列查询未过多公开的DNA和蛋 白质数据库(Altschul等1990J.Mol Biol.15，pp.403-410)。

B. 结果和讨论

1.标签标记的胸膜肺炎放线杆菌突变体的增殖

修饰在胸膜肺炎放线杆菌中有功能的质粒pLOF/Km，使通过在微 型-Tn10元件中插入唯一SalI位点接受标记-标签。将PCR扩增的随 机标记-标签克隆到SalI位点，在大肠杆菌CC118λpir中获得大约 30,000个标记质粒的文库。通过与它们相应放射性标记标签的菌落印迹 筛选这些转化体的子集，选择含有强烈杂交信号的标签标记的质粒。除 去含有交叉杂交的质粒，收集48个独特标签标记质粒的池。将这些质 粒(pLOF/TAG 1-48)转化到大肠杆菌S17λpir中，通过接合独立转移到 胸膜肺炎放线杆菌4074NalR株中。

除去氨苄青霉素抗性质粒共整合体(0.5-1％)后，从48个单独的 接合中分离2064个转座子突变体，然后安排到43个池中，每个池中48 个突变体。10个随机选取的含有微型-Tn10-特异性探针的接合后体的 DNA印迹分析证实标记转座子是单一、随机插入(数据没有显示)。 然而，减毒克隆随后的序列分析显示在胸膜肺炎放线杆菌中微型-Tn10 的插入不完全是随机的。

2.胸膜肺炎放线杆菌突变体在猪中的标记标签的筛选

使用猪气管内感染模型筛选标签标记的胸膜肺炎放线杆菌突变体， 鉴定毒力中所包含的基因。根据以前的研究将细菌直接滴注进气管已经 显示喷嚏所产生的气雾颗粒足够小以至于能够渗透到下呼吸道内，避免 需要定居到上呼吸道(Kaltreider HB.，Immunologic and infectious diseases，the lung.(1976)pp.73-97，Kirkpatrick & Reynolds(Eds) Marcel Dekker，New York)。

按照猪宿主体内选择能够可重复地回收大多数单个突变体前，研究 了包括感染剂量以及回收方法的一系列试验因素。使用例如103、104 或105cfu的攻击剂量，感染剂量和出现疾病的临床或形态学体征之间 相关性差。此外，当用相同的池感染不同猪时，传代后池的杂交模式提 示指定池通过不同动物的传代后，失去不同克隆(数据没有显示)。这 种不一致可通过将攻击量增加到106-107cfu/猪克服。

在猪中进行的胸膜肺炎放线杆菌感染的较早的STM研究中[Fuller， 2000 Microb.Pathog.29，pp.39-51]，实验性感染后通过肺灌洗回收细 菌。然而，发现这种方法不可靠，产生基本上随机回收单个标记标签。 相反，我们观察到整个肺在HBSS中匀浆后，持续回收活菌。这两个决 定性参数的最优化导致回收大多数单个克隆(＞90％，感染后20-48小 时)，动物之间具有极好的重复性(见图1；比较A和B)。

筛选总计2064个转座子突变体(43个池，每个池48个突变体)用 于体内减毒，每个池接种至少两个不同动物。通过在无菌HBSS中肺的 匀浆回收存活的细菌。这种初步筛选鉴定了在输入池中存在但是在输出 池中失去或者显著减少的550个突变体。将这些潜在的减毒突变体重新 汇集成新池，将每个新池用于感染另外两个动物。这种第二次筛选后， 发现105/410个突变体在输出池中始终缺乏，保留这些突变体进行进一 步分析。

3.胸膜肺炎放线杆菌毒力基因的鉴定和分析

获得上述105个减毒突变体中每一个的转座子插入位点两侧DNA 的核苷酸序列，并用于搜索GenBank数据库寻找同源基因。在表1中 显示这种分析的结果，基因被分配到5个功能种类之一：细胞表面、运 输、代谢、应激反应、以及调控。将在编码与数据库中的蛋白无显著同 源性，或者与未知功能的蛋白或预测蛋白同源的蛋白的基因中的插入归 为“未知的”一类。鉴定了含有在53个单个基因中的转座子插入和许多 Tn10插入热点的105个减毒突变体。特别是，在推定的rfbP基因(在 第444密码子中的Tn插入)中独立地分离了7个相同的插入，在胸膜 肺炎放线杆菌fur基因中的4个插入中，3个位于第128密码子。有趣 地是，在本研究中鉴定的3个热点两侧的DNA序列彼此不相似，也不 与以前已经鉴定的插入到胸膜肺炎放线杆菌中的Tn10插入的共有序列 相似(Fuller等(2000)Microb.Pathog.29，pp.25-38)。

(i) 细胞表面

已知荚膜和脂多糖(LPS)基因中的突变降低胸膜肺炎放线杆菌的毒 力(Rioux等，Can.J Microbiol.45：pgs1017-1026，1999)(Rioux等， Microb Pathog 28：pgs 279-289，2000；Ward等，Infect Immun 66：pgs 3326-3336，1998)。突变体9C2在cpxC基因中含有转座子插入，其中该 基因编码在胸膜肺炎放线杆菌荚膜输出中所包含的蛋白(Ward和 Inzana，1997)。这种突变体在体内CI试验中用作对照(已知减毒)株。 在这个STM筛选中鉴定了在胸膜肺炎放线杆菌血清型1的O-抗原的 合成中所包含的5个基因。在O-抗原操纵子的基因9(突变体10B11)、 12(突变体25B7)、15(突变体15A9)、17(突变体12D5)、以及18(突变体 21B8)中含有插入的突变体(Labrie等，2002，J.Endotox Res.8：27-38) 全部都是减毒的。另一个突变体9B7具有编码在LPS核心的合成中所 包含蛋白的胸膜肺炎放线杆菌galU基因上游20个碱基的转座子插入。 以前证明galU的突变降低胸膜肺炎放线杆菌的毒力(Rioux等，1999)。 最后，突变体26A9在与lcbB同源的基因中含有插入，一种在脑膜炎奈 瑟氏球菌(N.meningiditis)血清型L荚膜或LPS生物合成中所涉及的 推定的双功能聚合酶。

4D4株在编码推定的脂蛋白的基因中含有转座子插入。4D4株显示 与多杀巴斯德氏菌(P.multocida)的未知蛋白有最高的同源性，但是其 与流感嗜血杆菌(H.influenzae)和睡眠嗜血菌(H.somnus)的脂蛋白 和推定的脂蛋白相似[Theisen(1993)Infect Immun 61：1793-1798]。睡 眠嗜血菌LppB结合刚果红染料(一种血红素的结构类似物)，并且提 示是毒力因子，但是这一直没有被正式地证明[Theisen(1993)Infect Immun 61：1793-1798]。最后，17A4株在与流感嗜血杆菌的P2膜孔蛋 白同源的ORF中含有插入[Duim等(1993)Microb.Pathog.14，pp. 451-462]。P2蛋白构成大约流感嗜血杆菌全部外膜蛋白中的一半，代表 对无法分型的流感嗜血杆菌感染的免疫反应的重要靶[Yi等(1997) Infect-Immun-65，150-155]。

(ii) 代谢

10B12株在ADP-核糖焦磷酸酶(adpP)基因同系物中含有转座子插 入。ADP-核糖(ADP-核糖来自NAD)的细胞水平的调节在预防蛋白的非 酶促ADP-核糖基化中很重要。大肠杆菌ADP-核糖焦磷酸酶催化ADP- 核糖水解成核糖-5-P和AMP，化合物可作为核苷酸代谢的一部分再循 环[Gabelli等(2001)Nat Struct.Biol.8，pp.467-472]。

10A11株在精氨琥珀酸合酶，argG，基因同系物中携带插入。精氨 琥珀酸合酶催化瓜氨酸和天冬氨酸转化成精氨琥珀酸，经所谓的天冬氨 酸-精氨琥珀酸支路连接尿素循环和柠檬酸循环。天冬氨酸-精氨琥珀 酸支路提供加工氨基酸的氨基和碳骨架路径之间的代谢连接。 (Glansdorff(1996)，精氨酸和多胺的生物合成，Escherichia coli and Salmonella(Vol.1)(Neidhardt，F.C.等人，编)，pp.408-433，ASM Press)。

在33C7株中，发现减小的损害发生在与编码F1F0ATP合成酶的 F1α亚单位的流感嗜血杆菌atpA同源的基因中。ATP合酶负责在需氧 或者厌氧生长的细胞中利用跨细胞质膜的质子电化学梯度合成ATP。通 过atp操纵子编码细菌酶的所有8个亚单位。在多杀巴斯德氏菌中atpA 基因两侧是atpH和atpG，而在胸膜肺炎放线杆菌中基因顺序是未知的， 以前在胸膜肺炎放线杆菌感染的发病机理中已经涉及了atpH和atpG两 者[Fuller(2000)Microb.Pathog.29，pp.39-51]。

在0A7株中，转座子使编码NAD(P)转氢酶β亚单位的pntB基因 失活。转氢酶是一种固有膜蛋白，其由两个亚单位α和β构成，组织起 来成为α2β2四聚物。转氢酶将NAD(H)和NADP(H)之间的氧化还原反 应与跨内膜的质子转运偶联(Penfound & Foster(1996)，NAD的生物合 成和再循环Escherichia coli and Salmonella(Vol.1)(Neidhardt，F.C. 等，编)，pp.408-433，ASM Press)。它在能量代谢、生物合成以及解毒作 用中起关键作用。

在19D5株中，转座子在胸膜肺炎放线杆菌mrp基因中插入。可得 到的部分胸膜肺炎放线杆菌mrp基因序列与流感嗜血杆菌和大肠杆菌 的mrp基因高度同源。在流感嗜血杆菌中，在LPS的Gala(1-4)βGal 成分的生物合成中涉及mrp基因，而在大肠杆菌中mrp中的突变影响 硫胺素的合成[High等(1996)FEMS Microbiol.Lett.145，pp.325-331； Petersen(1996)J.Bacteriol.178，pp.5676-5682]。在胸膜肺炎放线杆菌 中，mrp基因位于编码体内诱导RTX毒素ApxIV的apxIVA基因上游 大约1kb处[Schaller(1999)Microbiology 145：2105-2116]。

29B11株在napB基因同系物中含有转座子插入，该基因编码异二 聚体周质硝酸还原酶(NAP)的较小的dihaem细胞色素c亚单位。在流 感嗜血杆菌(和假单胞菌属(Pseudomonas sp))中，NAP是唯一的硝 酸还原酶，功能可能是在存在硝酸时支持厌氧性生长[Brige(2001) Biochem.J.356，pp.851-858；Fleischmann(1995)Science 269，pp. 496-512；Bedzyk(1999)J Bacteriol 181：2802-2806]。在大肠杆菌中情况 更复杂，除了NAP外，存在两个膜结合的呼吸硝酸还原酶 [Moreno-Vivian(1999)J Bacteriol 181：6573-6584]。有证据提示NAP 是用于氧化还原平衡的异化(dissimilatory)酶。此外，提示NAP在从 需氧条件转变到厌氧条件后对厌氧代谢的适应，替代还原剂的利用，或 者甚至在形成高硝酸水平作为一种自我防御机制抑制竞争细菌的生长 中起作用[Moreno-Vivian(1999)J Bacteriol 181：6573-6584]。与在厌氧 适应中的作用一致，在暴露于厌氧条件的细胞中，以Fnr-依赖方式诱导 鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)napB基因的转录[Wei和 Miller(1999)J.Bacteriol.181，pp.6092-6097]。

17B8株，在与流感嗜血杆菌ccmH同源的基因中含有插入，其中 该基因是肠细菌中包括NAP的C-型细胞色素的装配所必需的 [Thony-Meyer(1995)J.Bacteriol.177，pp.4321-4326；Kranz(1998) Mol Microbiol 29，pp.383-396]。CcmH是由ccm操纵子的最后基因编 码，并含有CcmF和CcmG，据信能催化细胞色素c脱辅蛋白质中二硫 键的还原并便于血红素附着[Kranz(1998)Mol Microbiol 29，pp. 383-396]。而在大肠杆菌中nap和ccm操纵子相邻，并可能共转录[Grove (1996)Mol Nicrobiol 19，pp.467-481]，它们在流感嗜血杆菌和多杀巴斯 德氏菌中位于不同的基因座[Fleischmann(1995)Science 269，pp. 496-512；May(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98，pp.3460-3465]。

4B9株在moaA基因同系物中含有转座子插入。在大肠杆菌中 moaA-E基因是从GTP合成molybdopterin必需的[Rivers(1993)Mol Microbiol 8：1071-1081]。Molybdopterin(molybdopterin鸟嘌呤二核苷 酸)是在包括周质硝酸还原酶的原核molybdopterin中发现的主要辅因 子。厌氧生活诱导moa基因的表达[Anderson(2000)J.Bacteriol.182，pp. 7035-7043]，鼠伤寒沙门氏菌moaA突变体削弱了它们在上皮细胞中复 制的能力[Contreras(1997)Microbiology 143，pp.2665-2672]。

突变体29B12在胸膜肺炎放线杆菌recR基因同系物中含有插入。 RecR蛋白是在重组(recombinatorial)DNA修复的RecF途径中包含 的蛋白；recR突变体在补平最新合成的DNA的子代链缺口中有缺陷 [Kuzminov(1999)Microbiol Mol Biol Rev 63，pp.751-813]。RecR中的 突变延迟大肠杆菌中SOS应答的诱导，这种突变体对UV照射和丝裂 霉素C敏感[Keller(2001)Mutat Res 486，pp.21-29]。

在26A10株中，转座子插入到与流感嗜血杆菌的thrC高度同源的 基因中。thrC基因编码苏氨酸合酶，在导致产生苏氨酸的生物合成途径 中的决定性酶(Patte(1996)，苏氨酸和赖氨酸的生物合成，Escherichia coli and Salmonella(Vol.1)(Neidhardt，F.C.等人，编)，pp.408-433， ASM Press)。肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)thrC基因同系 物中的突变在肺炎的鼠模型中降低这种生物体的毒力[Lau(2001)Mol Microbiol 40，pp.555-571]。

在26D12株中，转座子使GMP合酶，guaA，基因同系物失活。 GMP合酶催化从XMP合成GMP，作为嘌呤生物合成途径的一部分。 GuaBA操纵子中的突变降低包括大肠杆菌、福氏志贺氏菌(S.flexneri)、 和鼠伤寒沙门氏菌的多种肠病原体的毒力，ΔguaBA鼠伤寒沙门氏菌衍 生物显示有望作为活性减毒载体[Wang(2001)Infect Immun 69，pp. 4734-4741；Noriega(1996)Infect Immun 64，3055-3061；Russo(1996) Mol Microbiol 22，pp.217-229]。此外，以前在中无乳链球菌 (Streptococcus agalactiae)和多杀巴斯德氏菌中的STM筛选在体外生 长和发病机理中分别涉及guaA和guaB[Jones(2000)Mol Microbiol 37， pp.1444-1455；Fuller(2000)Microb Pathog 29，pp.39-51]。

突变体27A12在以前在胸膜肺炎放线杆菌中鉴定为tonB的基因中 含有转座子插入(Tonpitak等，Infect Immun 68：1164-1170 2000)(现在 称作tonB1)。发现该基因紧靠exbB，exbD以及转铁蛋白结合蛋白(tbp) 基因的上游，并且与它们共转录。相反，0F6株在编码与多杀巴斯德氏 菌和嗜血杆菌属(Haemophilus sp.)的TonB蛋白(现在称作tonB2) 同源的蛋白的ORF中含有转座子插入。此外，在0F6中转座子插入上 游区的序列分析显示存在独特的exbB和exbD基因同系物，提示胸膜肺 炎放线杆菌，同包括霍乱弧菌(V.cholerae)和铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)的其它细菌病原体一样，具有两个独立的TonB系统 (Occhino等，Mol Microbiol 29：1493-15071998；Zhao和Poole，FEMS Microbiol Lett 184：127-132 2000)。

35D11株在与流感嗜血杆菌dsbA同源的基因中含有插入。DsbA是 小周质蛋白并且是硫氧还蛋白超家族的成员[Debarbieux(1999)Cell 99， pp.117-119]。DsbA中的突变是多效的，影响包括细菌毒力因子、III型 分泌体系的组分、以及包括NAP的c-型细胞色素的多种传导型 (translocated)蛋白的产生[Yu和Kroll(1999)Microbes Infect 1，pp. 1221-1228]。在福氏志贺氏菌[Yu(1998)Infect Immun 66，3909-3917]和 多杀巴斯德氏菌[Fuller(2000)Microb Pathog 29，pp.25-38]的毒力中 已经分别涉及在dsbA和dsbB中的突变。

在26C3株中，转座子使谷氨酰-tRNA还原酶，hemA，基因同系物 失活，而在26D5株中，转座子在推定的尿卟啉原脱羧酶uroD/hemE基 因同系物中插入。谷氨酰-tRNA还原酶催化谷氨酸还原成谷氨酸1-半 醛，从谷氨酸形成δ-氨基乙酰丙酸(ALA)独有的第一关键步骤。从ALA 形成的下游，尿卟啉原脱羧酶催化尿卟啉原III脱羧产生粪卟啉原，是 在尿卟啉原III经原卟啉IX转化成正铁血红素中的第一步。血红素， 包括正铁血红素，是电子转移装置的关键组分，另外作为酶修复基在矿 物营养和氧化催化中起重要作用(Beale，，血红素的生物合成， Escherichia coli and Salmonella(Vol.1)(Neidhardt，F.C.et al.，eds)，pp. 408-433，ASM Press)。

在15A11株中，转座子插到与多杀巴斯德氏菌visC同源的基因中。 VisC编码的蛋白编码属于UbiH/CoQ6家族的推定的单加氧酶。UbiH 是泛醌生物合成必需的[Nakahigashi(1992)J.Bacteriol.174，pp. 7352-7359]，在原核生物质膜的呼吸电子链中起作用的异戊二烯化的苯 醌。泛醌和正铁血红素通过便于DsbA被DsbB的氧化，也在周质蛋白 的二硫键的形成中起作用[Kobayashi(1997)Proc Natl Acad Sci USA 94， pp.11857-11862]。

29A10株在与流感嗜血杆菌的prfC同源的基因中含有转座子插入。 prfC基因编码肽链释放因子3(RF3)，在存在GTP时，翻译终止后催化 从核糖体除去RF1和RF2的GTP酶[Freistroffer(1997)EMBO J 16 4126-4133]。尽管在原核生物中不是生存必需的，但是经RF3-GTP的 RF1和RF2的高效再循环对于最大生长率是必需的[Kisselev(2000) Trends Biochem Sci 25，pp.561-566]。

在26A6和33B7株中，转座子在与tRNA/rRNA甲基转移酶的trmH 家族同源的基因中插入。26A3株中被破坏的ORF显示与流感嗜血杆菌 yibK同源性最高，而在33B7株中显示与流感嗜血杆菌的yjfH最相似。

(iii) 调节

在这个筛选中鉴定了在环境的感应和协同调节中涉及的毒力基因。 发现高铁摄入调节剂的胸膜肺炎放线杆菌同系物fur在6C12株中失活。 显示Fur或Fur样蛋白在包括大肠杆菌(志贺样毒素)、白喉杆菌 (Corynebacterium diptheriae)(白喉毒素)、以及铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)(外毒素A)的多种病原体中调节毒力因 子表达[Prince(1991)Mol.Microbiol 5 pp.2823-2831；Schmitt(1991) Infect Immun 59，pp.1899-1904；Calderwood(1987)J.Bcateriol 169， pp.4759-4764]。21D3和19B10株分别在胸膜肺炎放线杆菌rpoE和上 游mclA(rseA)基因同系物中含有转座子插入。RpoE编码σ因子， σE/σ-24，是σ因子的胞质外功能亚家族的成员，其中σ因子作为效应分 子在对包括热休克和氧化应激的胞质外刺激的反应中起作用[Raina (1995)EMBO J 14，pp.1043-1055；Rouviere(1995)EMBO J.14 1032-1042；Ades(1999)Genes Dev 13，pp.2449-2461；Dartigalongue (2001)J Biol Chem 276，pp.20866-20875]。在鼠伤寒沙门氏菌中，σE 是毒力和免疫原性的重要决定子[Humphreys(1999)Infect Immun 67， pp.1560-1568l。MclA(RseA)是作为σE特异性抗σ因子起作用的内膜蛋 白。MclA(RseA)在对胞质外应激反应中迅速降解，导致σE浓度增加以 及引发应激反应[Ades(1999)Genes Dev 13，pp.2449-2461]。最后，观察 到在胸膜肺炎放线杆菌固有感应luxS同系物中的插入(26D3株)降低 胸膜肺炎放线杆菌毒力。最近，在EHEC和EPEC两者中，在由肠细 胞脱落致病性岛的基因座所编码的肠定居因子的调控中涉及大肠杆菌 luxS同系物[Sperandio(2001)J Bacteriol 183，pp.5187-5197； Sperandio(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96，pp.15196-15201]。

(iv) 运输

胸膜肺炎放线杆菌基因aopA在23C9株中失活。AopA基因编码被 检验的胸膜肺炎放线杆菌中所有血清型共有的48kDa免疫原性外膜蛋 白[Cruz(1996)Infect Immun 64pp.83-90]。有趣地是，AopA与流感嗜 血杆菌的Nqr1(解藻朊酸弧菌(Vibrio alginolyticus)的NqrA)高度 同源(75％相同，84％相似)，编码钠-转运NADH-泛醌氧化还原酶 (NQR)复合体的α链[Hayashi(1996)FEBS Lett 381pp.174-176；Beattie (1994)FEBS Lett 356pp.333-338]。NQR酶是连接呼吸的建立跨膜钠离 子电化学梯度的Na+泵。得到的钠动力可用于溶质转运、ATP合成、以 及鞭毛的旋转。这种偶联钠离子而不是质子的交替能量使细菌在碱性环 境中能将细胞质的pH维持在接近中性。在解藻朊酸弧菌中NQR酶是 最广泛研究的酶，据认为其是在pH和离子稳态中包含的酶[Beattie (1994)FEBS Lett 356pp.333-338；Unemoto(1993)J.Bioenerg Biomembr 25pp.385-391]。在霍乱弧菌(Vibrio cholerae)中，通过其 对ToxT表达的影响在毒力因子表达的调节中涉及NQR复合体[Hase (1999)Proc Natl Acad Sci USA 96 pp.3183-3187]。

鉴定了胸膜肺炎放线杆菌毒力必需的几种不同推定的ABC运输系 统的组分。ABC运输系统是在高分子跨细菌和真核生物细胞质膜的不 同排列的运输(摄入或流出)中包含的系统。这些系统通常由三个基本 部分构成：一个或两个ATP酶，一个或两个整合膜蛋白以及底物特异 的结合蛋白。13B12，0C5，19D1，和24A4株在ABC转运装置的ATP 酶组分中含有转座子插入。在0C5株中失活的基因编码与原核半乳糖转 运装置的MglA具有显著同源性的蛋白(Richarme等，J Biol Chem 268： 9473-9437，1993)。这种突变体的体内CI表明在呼吸道环境内某些糖的 有限的有效性。在19D1和24A4株中被破坏的ORF与多杀巴斯德氏菌 (分别是PM1728和PM0996)中未知特异性的运输系统的假定的ATP 酶同源。在20D10株中，转座子使与杜氏嗜血菌(H.ducreyi)的znuA 和流感嗜血杆菌的pzp1具有广泛同源性的基因失活(Lewis等，Infect Immun 67：5060-5068，1999；Lu等，J Biol Chem 272：29033-29038 1997 and FEMS Microbiol Lett 165：129-1371998)。ZnuA(PZP1)是在锌摄 取中起关键作用的周质锌-结合蛋白。在杜氏嗜血菌中znuA基因的失 活导致在实验性软下疳的兔子模型中毒力显著降低(Lewis等，Infect Immun 67：5060-5068，1999)。在0D6株中，转座子在编码与多杀巴斯 德氏菌(PM0997)和脑膜炎奈瑟氏球菌(N.Meningitidis)(NMB0549)的 推定的固有膜蛋白同源的蛋白的基因中插入。在多杀巴斯德氏菌中 PM0997位于紧靠在24A4株中失活的ATP酶的上游，提示它们是相同 运输系统的一部分(May等，Proc Natl Acad Sci USA 98：3460-3465 2001)。这个基因也被Fuller等鉴定为apvD(Fuller等，Microb Pathog 29： 39-51 2000)，其预测的产物显示与大环内酯特异性ABC型流出蛋白 MacA同源(Kobayashi等，J Bacteriol 183：5639-5644 2001)。在突变体 9D10中，被破坏的基因序列编码与调节镁流入和流出以及钴流出的 CorC同源的蛋白(Gibson等，Mol Microbiol.，5：pgs 2753-2762，[1991])。

(v) 应激

在13A3株中，转座子在dnaJ基因同系物中插入。DnaJ是细菌的 Hsp70伴侣系统的基本组分，其中其作为共伴侣起作用，提供对其Hsp70 伴侣，DnaK，底物特异性[Rudiger(2001)EMBO J 20 pp.1042-1050]。 除了它们在蛋白折叠和运输中的基本作用外，DnaK/DnaJ构成大肠杆 菌热休克反应的初级应激感应和转导系统[Tomoyasu(1998)Mol Microbiol 30 pp.567-581]，其中它们通过改变热休克σ因子σ32的稳定 性，调节热休克反应的诱导。有意义地，以前已经证明DnaK中的突变 降低胸膜肺炎放线杆菌毒力，降低猪布鲁氏菌(Brucella suis)在人巨 噬细胞样细胞系中的存活[Fuller(2000)Microb Pathog 29 pp.39-51； Kohler(1996)Mol Microbiol 20 pp.701-712]。

26B6株在htpG基因同系物中含有插入。HtpG是热休克诱导的分 子伴侣，其在大肠杆菌中有助于在适度应激的细胞中细胞质蛋白的正确 折叠[Thomas(2000)Mol Microbiol 36 1360-1370]。HtpG似乎不与伴侣 蛋白稳定联系，关于其作用机理知道很少。建议HtpG用作固定器伴侣， 在可进入DnaK/DnaJ的构象中短暂地维持de novo合成蛋白的子集 [Freeman(1996)EMBO J 15 pp.2969-2979]。

13D8株在lon基因同系物中含有转座子插入。Lon(也称作蛋白酶 La)是可热休克诱导的，依赖于ATP的丝氨酸蛋白酶，在除去异常折 叠蛋白中起重要作用[Gottesman(1996)Annu Rev Genet 30 465-506； Suzuki(1997)Trend Biochem Sci 22 pp.118-123]。除了其被证明的作为 应激反应蛋白酶的作用外，Lon也通过降解不稳定的调节蛋白作为基因 表达的多效调节剂起作用，其中调节蛋白包括RcsA，荚膜合成的正调 节剂[Keenleyside(1992)J Bacteriol 174 pp.8-16]和SulA，细胞分裂的抑 制剂以及大肠杆菌(E.coli)SOS反应的组分[Mizusawa(1983)Proc Natl Acad Sci USA 80 pp.358-362]。最近在流产布鲁氏菌(Brucella abortus) 中的研究已经证明Lon是在鼠巨噬细胞中生存和在感染的小鼠模型中 野生型毒力所必需的[Robertson(2000)Mol Microbiol 35：577-588]。

13C1株在prc基因同系物中携带转座子插入。Prc是一种周质蛋白 酶，其天然底物似乎是包括TonB的膜蛋白[Gottesman(1996)Annu Rev Genet 30 pp.465-506]。据推测Prc作为蛋白在周质间隙中的折叠和转换 中所包含的伴侣蛋白起作用[Bass(1996)J Bacteriol 178 pp.1154-1161]。

                           序列表

<110>Imperial College Innovations，Ltd.

<120>细菌毒力基因

<130>MRM/PJG/24342

<150>GB 0228691.2

<151>2002-12-09

<160>63

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>3344

<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)

<400>1

gaattctaaa ttgagctgcc aatgcttgtt gttcgtcaca attcacggtt gccaataaaa  60

attgtgccgg attttcatcc gccaaccggc gtaataatga atccatttcc aatgaagcca  120

cttctctcgg cgagataaaa ttaaacacga ccggcacttg tgtcgccgca ttccacactt  180

cactaaaatt actttcggta acattgacaa aataattcat actcttttcc taatctaaaa  240

aatcggcaaa ttatacttta tttttagtaa gccgtttcaa tcggtaaacc gcttctttcc  300

caaccgtcga aaccgccttt cacgctatat acgcgatcaa aaccctgttc gactaaaaat  360

tgtgcggtat tacgactgct cacgccgtga tagcacatga cgatgaccgg ttcttcataa  420

tccacttcat ctaaaaaacg cccgtagctt tcattagtta aatggaacgc atcttgcgga  480

tggctatagg cataacgacg tccatcacga atatccgcta aagtcgcacc ttcgttttcg  540

attaattccc acgcctgatg cgggctgatc tcagtaaatg tttcactcat atttcatgct  600

caataagaaa aataaaccaa ataaaattaa tcgactatac cataagacgt ttacaaaaat  660

aaacgagaat acctattatt acgagttgaa ttttctgact tacttagtat aattgcaaac  720

cattttcatt atacagaact cactgtttgc ttcttttaga ctgtttccga ggattttatg    780

gaacaaatgc ttgaactttt acaaggtcat gttgattata ttattttagg cttattacta    840

ttaatgagtg ttgtgttggt atggaaaatt attgaacgcg tacttttcta caaacaattg    900

gatgtgacca aatatgacac gctacaagat ttggaaattg ataccactcg caatttaacc    960

accatttcca ctatcggtgc caacgcccct tatatcggtt tattaggaac cgtattaggg    1020

atcttactta ccttctatca tttagggcat tccggcggtg atattgacgc cgcatccatt    1080

atggttcacc tttcgcttgc attaaaagca accgcagccg gtatcttagt cgctattccg    1140

gcaatgatgt tctacagcgg ttttaaccgt aaagtggatg aaagcaaact taaatggcaa    1200

gcgattcaag ctcgtaaagc caatcaataa gcggtcaaat ttcacttatt ttttgcaact    1260

caatcaggct tcttatgaaa aaatttgacg aaattaatat tattcccttt atcgacatta    1320

tgttggtatt actggctatc gtgttggtaa ccgcttcatt tatttctcaa ggaaaaattc    1380

cggttaatat tccgaaagcg accacaactc aagcgatgaa agcggacgaa ttggcaaaac    1440

ttctgacgat taccgaaaac aacgagtttt atttcaacga tcagccgatt accaaagaag    1500

cactcacgag cgagattgca acttgggata aaacccaaaa agtaacctta aaagtggacg    1560

gtgcggtagc ctttgaaaaa tttgtcgaac tgactgatgt tctctctgcg aatgaaatta    1620

agaatgtcgc tatcgtgacc aaaaaagata cctcgaagaa ataggatacg agtatgaaga    1680

aaaaacattc tcgtatcggt ttaaccggct ccattcttat ccataccgct attttcggcg    1740

gtttagcctc tatggtaacc cattctcatt ccgatgattt accccaagaa gaaacgatgt    1800

ctatggagtt agtcgccgca cttttggaac aacctcaagt tgccgtcgca caagaagagc    1860

cggcaccgcc ggagccggag aaagtcgaag tcgagccgga accggagcct gaagcggaag    1920

ctattccaga acttaaacct cagcctaagc cgaaagaaaa accgaaggaa aagcctaagg    1980

aaaaaccaaa accgaaagaa ccgccaaagc ctaaagaaaa agaaaaacct aaaaaagaga    2040

aagtaaaaga taaaccgatt aaggcgttag aaaaaggtcc tgaagcaaaa caaggtattg    2100

tcgccaaagc gattcctaat gcggtacaag gcactcaatt acgtgcaggt attccaaacg    2160

gtaaaccgga aggtaatccg aacggtcttt ccgccaacgg ttcacaaaac ggtgcggtag    2220

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gtgcattaca acgccgagcc aataacgctt atccgactcg agaaaaaatg atgcgcaaaa    2340

cgggcgtggt tactatcggt tttaccgtat cctcttccgg cgagttaatc aatgtcaaag    2400

tgttaaacag ttccggtaac ggtaatcttg ataatgcggc ggtcaaagcg gcacaaagca    2460

cgaaagtttc accgccgccg gcgggattcc cgagtaatgt gaccgttccg gtgaaattct    2520

cgattgaata aatcttgtca ataagctccc gtaagggagc ttatttttac ttaagccaag    2580

cggtcgtttt tagcttactt gttgcaaaaa atcgacaaaa gataaccgct tgcctaaagc    2640

ggagtgctta agtaaaataa accgtttcta tttttattat acaaattgag gaaaatataa    2700

tgtttggaaa aggcggctta ggcggtttaa tgaaacaagc tcagcaaatg caagagcgta    2760

tgcagaaaat gcaagaagaa atcgcacagc ttgaagtcac cggcgaatcc ggtgcgggtt    2820

tagtcaaagt aacgatcaat ggcgcacata attgccgtcg tatcgaaatc gatccgtcat    2880

taatggaaga cgataaagag atggtggaag atttagtcgc tgccgcattc aatgatgccg    2940

ttcgccgtgc ggaagaaatg caaaaagaaa aaatggcaag cgtgaccgcc ggcatgcaat    3000

taccgccggg catgaaattc ccattctaat ttagagataa tggatagttc gctttattgc    3060

ggctatccat tattaatttt caactatccg gtctattaaa gcaaattagc cctttactcg    3120

aaaatctgat ggaagacata agagccctac gtgcattacc cggcgtcggt ccgaaatccg    3180

cacaacgtat ggcgtatcat ttattgcaac gcaatcgttc cggcggtatc aatttatcca    3240

aagccttaaa tgaagcgatg acgcatatcg gtcattgccg ttcttgccgt acttttaccg    3300

aagaagacga atgcaatatt gttgatgcgc tggcagtgtt cctg                   3344

<210>2

<211>1080

<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>2

ttgaaagttt caccatatat tggctcaagt tattattcat ctaaatatac agattattac  60

tttggtatta aacaatccga attaggtaat aaaattacat ccgtatataa acctaaagca  120

gcttatgcaa cacacatagg tattaatact gattatgctt tcacgaacaa tcttggcatg  180

ggtttatctg tcggttggaa taaatattct aaagaaatta agcaatctcc tatcataaaa  240

cgagactctc aatttacttc atctcttagc ctttattata agttctaaaa tagaatattc  300

tagggagaat actcattctt tatctttata aagttaattg tttctccctg tttctatatt  360

atttagttac ttgttcaaaa gctacattgg ttattttgtc attttataaa agataataag  420

gtggttattt tgaaaattaa gaaatatatt aaatataccc tatttacttt ccttttaggc  480

atatcatatt tatattttgg gggcgaaaac gaaaattatc aagagattat ttttcacgtc  540

gaacgaggaa atattcaaaa aacagttatt gctagcggca cattgcaagc gactgaacaa  600

gtagatattg gtgcacaagt atctgggcag attaagcata ttttagtaca agaaggacag  660

aaggttaaaa aaggtgagct attagctgta attgatccac gtctggctga aacggaatta  720

aaactagcaa aagctgagct agcaaatgct tctgctaatt tggatacaaa aaaaattaat  780

cttaagcaac tgcaatcaga ttgggaacgt catcaacgtt tgatacgaac caatgcgaca  840

agccaaaagg aaacagaaga agcaaaaagt agattaaata cggccaaagc agaacttcaa  900

attgcgcaaa ataatctaga tatcgctaaa atcagagtgg aaaaagctga aaccgaacta  960

ggatatacag aaattcgttc tccacttgat gcaacagtaa tttcagtatt tgcgcaaaat  1020

ggtcaaactt tagtcaccac ccaacaagta ccagtgctga tgaaattagc taatattgat  1080

<210>3

<211>582

<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>3

cgggtattat ttatatttcg cacaaaatgg atgaaatctt caaaatttgt gacgaaatta  60

caatcttacg tgacggtaaa tgggtcaata cggttgcgat taaagacacc tcaatggaac  120

aaatcgtttc gatgatggta ggtcgtgaac tgacccaacg tttcccggaa aaaaccaata  180

agccgaaaga aaccgtactc gtggtcgaac atttaaccgc taaaaatcag ccgtctattc  240

aagatgttag ctttgaattg cgtaaaggcg aagtgttggg tatcgccggc ttggtcggtg  300

caaaacgtac cgatattgtc gaaacgattt tcggtgtgcg tgaaaaagcc ggcggaacta  360

ttaccttaaa cggcaaagcg gtaaacaatc gtaatgcgtt tgaagcaatc aataacggtt  420

ttgcgctggt tactgaagaa cgccgctcaa ccggtattta tgcgaatctc agcatcgaat  480

tccactcgtt gatttcaaat atgaaatctt atttaggtaa gttcggctta ctcagcaata  540

aaaaaatgaa aagcgatacc cagtgctgat gaatccccta at                     582

<210>4

<211>1264

<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>4

ggactttcta aacacgaacg gccaaaagcg ggttgttggt ccggtatcgt cgggatggcg  60

attgcgttag tcgcaactat cttcgggtcc gcaatcacaa ggtacgcttt ggatttaatc  120

gcaatggcaa tcggcggatt tatcggtgtg agaaaagccg taaaagttga aatgacggaa  180

atgccggaac tagtggcgat tctacatagc tttgtcggtt tagctgcggt attagtcggt  240

tttaacagct acggtttaca cgtagatgcg attccaccgg caaacttaga tgaagtggca  300

ctagcggcat tccaagccga acaagcgata ctcgctaaca ttcataatgt tgaagtgttc    360

ctcggtatct ttatcggtgc ggtaacattc tccggttcat tagtggcgtt cggtaaatta    420

agcggtaaat tattcggtcg taaagtgtct tcggctgcat taaatattcc gcataaacat    480

aaatggaact tagcggcatt aatcgtttct gcgttattaa tggtggtatt cctaaataat    540

ccgcacaata ttttccctgt gttgattatg acggtaatcg cattagtatt cggttggcac    600

ttagtatcct ctatcgctgg tgcggatatg ccggtagtgg tttcaatgtt gaactcatat    660

tcaggttggg cggcagcggc agccggattc atcagtgcta acaacgactt attaattgtg    720

actggtgcgt taggggttca tcagcgcgat tctttcttac atcatgggga aagcgggaac    780

cgctcattta tcagcgtgat tgcaggcggc ttcggtacgg aagttaaagc aagctcaggt    840

gatgaagaac aaggtgaaca ccgtgaaacc accgcagaag aagtggcgga aatgctgaaa    900

aatgcaagtt ctgtaatcat cactccggga tacggtatgg cggtggcgca agcacaatat    960

ccggttgcgg aaatcactgc aaaattacgc gagaaaggtg ttaatgtgcg ttttggtatc    1020

caccctgttg cgggtcgttt accggggcat atgaacgtat tacttgcaga ggcaaaagtg    1080

ccttatgatg tcgtgcttga aatggatgaa atcaatgatg atttcgaaga aaccgatgtc    1140

gtattggtta tcggtgcgaa tgatacggta aaccccgcgg cattagacga tccgtcaagt    1200

ccaattgcag gtatcccgta tttgggaagt gtggaaagca caaaaccgtt atcgtatcaa    1260

cctt                                                                 1264

<210>5

<211>574

<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>5

tacgcaacag gataaaaaat cgtttttaca atcgattttc agcggcttat  ttcaatccga    60

accgaaaaat agagaagact tggttgaagt aattcgagat tctctggata acgaactgat  120

cgatagtgat accaaagata tgatcgaagg cgtaatggag atttccgaac tgcgtgtgcg  180

ggatattatg atacctcgtc cgcaaatcgt ttatattgac gccaatcttg atcttaccgc  240

ttgtgttgat ttaatcattg aatccgctca ctctcgcttt ccggtcattt tagacgacgg  300

caaagatacc gtattaggta ttttacatgc caaagatctc ttaaaattcc tcagaaccga  360

ttccgaagag tttgaaatgc caaccattct acgccctgca gtgattgtgc cggaaagtaa  420

acgggtcgat agaatgttga aagaattccg ctccgaacgc tttcatatgg cgctggtagt  480

ggacgaattc ggtgcggtat ccggcttagt cacgattgaa gatattctcg agcaaatcgt  540

cggcgatatt gaagacgaat tcgacgaaga agaa                              574

<210>6

<211>575

<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>6

gatatcgtat cacataagta aagaccgctc gcataagcga agcggttcta atttcatcta  60

aagttttact cgtgtactga cgaagtaatg caaggatttg catcagtttt ctcttgcatt  120

aatactttat cgccgcgagt ttctaaattt aagcgtacaa caggttcggt atttgaactg  180

cgtaagttga aacgccagtt ttcaaattca acgctgatac cgtctaaggt ttcgacttta  240

ccgtctttat acgcttcttt aacacgttcg atagccgctt tagcatcagt taatttactg  300

ttaatttcac ccggtgacgg gaatttatcc aaacgagcac cgactaattc gcttaacggt  360

ttacctgtcg tacatagtag ttctaacgtt aatagccatg gaatcatacc gctatcacag  420

tagaagaaat cacggaaata atggtgagca gacatttcac caccataaat cgcatctact  480

gcgcgcattt tctctttaat aaacgagtga cccgattttg acatcaccgc ttcgccgccg  540

gcttccgata ctaattcttc cgtattccaa attaa                             575

<210>7

<211>379

<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>7

tactaaacct tctttaccac ctaagataga aacgaacgca ccgaagtcca caacgcgagt  60

tactttacct ttgtagatcg cgttcacttc aacttcagcc acgatatctt cgatacgagc  120

cattaccgct ttcgccgcat tattatcggt tgcggcgatt tttacggtac cgtcgtcatc  180

aatatcaatc gaagtaccgg tttcttcggt taatgcgcga attaccgcac cgcctttacc  240

gatcacgtct ttgattttct tcggatcgat cttcatcgta tgaatacgag gcgcaaaatc  300

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cgcacctttc gcttgattt                                               379

<210>8

<211>876

<2123DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>8

attagcagta acagggtgat taacttataa tttatagggg tttttatgaa atcagataaa    60

ccggttgaat gtgtgggttg taacactttt gatgtcggct caatcattga taatagtgaa    120

cgagatgcga aatttgcaaa agtatatgaa acacaagcgg aagcggaaca agcacttgtg    180

aaattaaccc aaaaagcacg cgatacggaa agcgaaccgt gtgaaatcac cagtgaaatt    240

aaagcggtag agggcggttt tttactggat gcgaatttcc gttttagttg ccaagcggaa    300

gtggtaattt tccaattagg tacacgcgca atccgcgcaa tctaatttta ttaatttgaa    360

aagcggttgg attttgctga aaatttgcaa aaaatgagca aaatccaacc gcttttgttt  420

tcggagaaat tgatgaatcc ttgggtttta ctaggctttg cgattgttat tgaagtgatt  480

ggcagtaatt gcattaaggc aagcgaaggt tttagcaaac cgctaccgac cgtagtggcg  540

atcggcgctt ttgtgatagc gttatattta ttgtcggtga ttaccaaaac attgccgatt  600

ggtattgttt atgctgtgtg gtcgggtgtc ggtatcgtac tgaccgccat tgtggcatat  660

ttcgctttcg ggcaaaaacc ggatttggcg ggctttatcg gtatgggaat gattattgcc  720

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ttaaggctgg tcgccggcta acgcacgagg gaataa                            876

<210>9

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<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌

<220>

<221>misc_feature

<222>(489)..(489)

<223>n is a，c，g，or t

<400>9

agtcatcggt atcttcggtt gcggtgacca agaagattat gcggaatatt tctgtgatgc  60

gatgggaacc attcgcgatg tcgttgagca aaacggcggt gtgattgtcg gacattggcc  120

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taaacagatc tttgatgaga tgtgcttaga tcagttagca taatgaatat aagagagaga  300

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tactgagcct cgtttgacca tccttgcgtt aatgcagcaa catcgcgaac aaatgctaca  420

tttttctgcc gaggatattt ataaaatttt attagagcag ggttccgata tcggtttggc  480

aacggtttnc cgcgtattaa accaatttga agaggtcggt attttacttc gccataactt  540

tgatgcgaat aaagcggtat tcgagcttaa cgtagagcaa gaacacgatc atattatctg  600

tatggattgc ggtaaggtat tcgagtttaa agatccggat atcgaacgcc gtcagcgtga  660

aatcagcgaa cagcacggta tgaaattagc gacgcacagt ttatatctct atgcgaaatg  720

tagcgatatt tcacattgtg attcttcaaa agataaaaaa taatttatct tatcgttcag  780

tataaagcag acatataccg aaggttttgc aggccttcgg ttttgtgtta tctaaaggat  840

atgaaattaa gcggttgttt tgtaaaattt ttagtaaaaa cgaccgctat ctgaaagaga  900

cctcgattta atgacggata atatttcaca gcctgtagag gccaaggttc gacagcctcg  960

taaaatctca cctttttggt tactaccaat cgttgctttc gtgattggcg gattgttatt  1020

tttccagatc cttaaagagc agggcgaaat gatcacgatt cgtttcaacg aaggcgacgg  1080

gatcaccgca ggaaaaaccg tcattcgcta ccaaggtttg cagatagggc aagtgaaaaa  1140

agtctatttt gtagaagatc ttaaaaaagt cgaagtgcaa gcggaagtga atcccgaagc  1200

caaatccgtg ttacgagaac aaaccaaatt ctggtggtaa aaccgagtcc t           1251

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<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>10

gattcgattc aatcggtaga aatgccggcg tctatggcat cggctccgtc acggacaatc    60

gagcaaaata ccgcttataa taatcaaacc gcttatacgc aaccggttaa tagcgtaccg    120

caacagcctg tggttcaaac tccggtacaa tccgcaccga gctatacaag cgaaagcggt    180

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tatgcggaaa ttaccaaagg ttgttatacc gatagtagtt atacggtcgg aaaaagcgat  300

acaatgtatt taatttcgta tcttaccggt caaacgccgg cacaaattgc ggcattaaat  360

aatctcagtg tagagagtaa attacacgta ggtcaaatac tgcgtgtaag ataacggtag  420

gtttattttg ttagtattaa cgacagttgt gctttgccgc tgtcgtttta ttcgttttta  480

gattttaaag gaaagtaata tgaaaaaggc atttttatta ttgccgttta tggtaagcct  540

gaccgcttgc ggagcaagtg agaacgcacc gaaagacgat gcggaattgg cgccggggat  600

tatgcaaccc gtttccggat caggcgcatc gacaggaagc tacggttggt cgtcagacgt  660

tgagtccgca ccgatgccgg cttcaatgac taaataatcg ttttagcata cgaaaggata  720

aattgaacag atgaagaaat catttttt                                     748

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<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>11

tgcaacgctt gttacaagaa ggctggcaat tacagccaaa agcgttatcg gacggcccgg  60

cgaaagtgct ttcacaccct gattaccaag gcgaaatcgg tttgattatg ccgtatgaga  120

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cgcaattgaa agcacgctta aaagccgcat tacaaggtaa acgggaacat cactatttgc  300

atatcggtga tagcgggatt cgaaataacc tcgcctcaat cggcggctag tttctctgtt  360

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gttcttcact tagttgaaat ttgcttaacg gaacatttta gattcgccta cggctcaaga  480

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<400>12

tgctaagcat gaagaacgta ttgcgaaaga acctgagttt attacgttaa acgaagatat  60

tgcaatccgt aaagaaagag gcgctcgcaa gtattcgtca ctgaatctgg aagagcgttt  120

gaaagaagat cgtgccgacg aagcgaaacg tctgaaagat ctgaatgcac gctttgcaag  180

ggaagggaaa aaagcgatta agaatattga cgccttaccg aaagactatg aagcgccgga  240

ctttttctta aaagaagctg aaaaaatgat ggttgattgg ttagaaattg ataagaagtc  300

ataaaatagc ttataatgta ttaaattagc tgccgcttaa tgaaagttag gcggtttgtt  360

tttattgata ttttataatc tcggagctaa ggatttttat atgagtaagg cgaaaacctt  420

caaattactg ccgttagtaa tgctttcaag tgtcgtttta gccgaaacta atgcaactca  480

tcttcaggct gcatcaacag aaaacgcaac ggttaatcat gcgacatcgg atgcaatttt  540

accccagcta agttttagcg ctcagcaggc tagagcggct gaacttgcaa aacgtgcgga  600

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gaaagtagca aaagcaaaga aaacaaaaac gcctgagctg gcaacggcaa ccggtaacga  1200

tacgttctat aaattagc                                                1218

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<213>胸膜肺炎放线杆菌

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attctaggtc gtcagtctga gaatttaact cgtgcatggg catatgcgat ggcgttaggt  60

gtggaagata aagtaaaaac cgcactcttt gaagcggcgc aaaaagatgc aatgaaatca  120

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tttaaaattc gcggcgtacc ggcgtttttc ataaacggac agtaccaaat caatttggaa  300

ggctttgccg attccgcatc aaccaacgaa tttgtgaaac gttatgtaga agcggtgact  360

tttttaatta aaaagtaaat taagggcata gtagacaaaa tggttgctat tttttgaaaa  420

actatgccaa gtggacaaag tggtggctaa atagtatttt ttattttatt tagccactct  480

ttttatttaa aaaatccttt ataaacataa cattatgtga cttacttaat ccattatgat  540

tatttaattt ccgcttcagt tcactaaata atccttccag tctatttgtc gtcttttcaa  600

tatttaattc cgggtatttt tcataagtaa aaatataatc catataacgt ttaatactcg  660

cataagcact tctcacattt caatgtttat agggaaaata accctgctca tt          712

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tgcttagttt agacggtgta ccggcaatta aagcgattgt cgatgcaacg gaaaaacatg  60

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acgatcataa acacgaccat gcagggcatg atcatcacca tgatcacgaa gggcatagcc  180

atgataaaga ttggcatatt tggttctcac cggaagcaag ccttgccgcg gcggaacaaa  240

tcgcagcacg tctaagcgca caattaccgg aacaaaaagc gaaaattgcg gaaaaccttg  300

caacatttaa agcaaattta accgctaaaa acgaacaaat tcgcaatcaa ttagcagcag  360

taaaaggtaa aggttattat actttccatg atgcttacgg ctatttcgaa cgtgcttacg  420

gattaacctc attagggtcg tttacgatta acccgagcgt agcgccgggg gcgaaaacgt  480

taagcgtaat taagaa                                                  496

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<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>15

agctctacat catctaaata accgaattca gcagcaaaaa gaactaatgc ttgttcgctt  60

accagcattg gagcaaattg tttttgttta agtaattccg tcactttttg accgtgagaa  120

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cgatactgag ctaatgcggt acggataccg ccagataatt tcttgatagc tttagtttgc  240

gccgcagaac ctacacgaga tacggaaata cccgggttta ccgcaggacg aatacctgag  300

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acgaaagccg atacgtcacc cgcttgtgtc tcgataatcg gaatgcag               408

<210>16

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<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>16

cgcttaaccc cgttactaaa tgagttcaac gtttaggtat ttccgttcag caagtaaacc  60

gccaaacatt ggataacaaa gcgcaaggtg aagttcacca agggattatt gcgaaagtcg  120

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cggcaggtga agcgacttcc ggtatttatc aggctaaatt aaccggtgct atcgct      476

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<211>1011

<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>17

attgcgcaaa atgctaacag aattatcaaa atcaaagatg gcgaaattat tgcagataat  60

agttcatact gcaagaatag cctctccccc tcaacaaagc aggaaaggca aagtctaaac  120

tgcttgatgt cgctacgagg ctataaagaa tcttttgtga tggcattcag tatgatgcgt  180

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aaaattcaaa cgttaaatag caatgacgta aatttattac gccaacaacc ctatgtgaaa  420

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gcaacgataa atggtgttag ccaagatttc tttatgttaa aaaactacaa attactaagt  540

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gatgtaccta tttcgattat cggtgttgtt gagtccgcct cccaaacaac tgaagggcag  720

cgaaccacta tttggttacc gtacaacact atggctgctc gtttacgtaa ccaaccctat  780

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tcatctatcg cttttatttc gctggtagtt ggaggtatag gagttatgaa t           1011

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<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>18

tcgacgctga gcgtctttat atgggcaatg gtgaggggta gttttacctt ttgcataggg  60

tgtgcatatt acagatagaa agcaaaatag tcaaagagaa aatcggattt ttaaaaaata  120

tctcataagc taaactaaat aaaccgaacc ggtttgatat aaggtaaact tatagaaatt  180

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<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>19

gcaatacctg cactcgggcc gtctttcggc gttgcgccgt ccggcacgcg tacgtgaata  60

tcacgttttt catagaaggc atccgcactg cctaattgtg cggatcttgc acgtaccacc  120

atcattgccg cttgaatcga ttctttcatc acatcgccta atgaaccggt aaatgagaat  180

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ctacgcacac cagcttcacg agtgtagtaa cgaataatgc ttaaaatagc actatcttcg  480

atagttaatt cacccgcttt taagccgtta ttttcttgct gtttggcaat taagtggtca  540

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<210>20

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<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>20

agcgaagcta ccgctcgaag taaaagaaaa actagatagc gagtttaaaa agttaaaagc  60

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<210>21

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<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>21

agtacctttt caaagcttgg gttgcttttg caaaccaaga ttggattagc gtaatctcat  60

tacttgaaag taagctctct gagttaagta aaaaagactt agatttatat ttgcctgagc  120

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<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>22

ggctttgcag tagcggaaac gcaaaatgta tcgtcggata aattaccgga aaatgtggcg    60

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<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>23

tggaagtgac tcgtctgcgt gatacgccga tcttaacttt tatgaacaaa ctcgaccgtg    60

atatccgtga tccgatggag ttactagatg aagttgaaag cgtcctaaaa atccgttgtg    120

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<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>24

cacgcggtac ggatgtcatt ttacatttgc gtgaagcaga aaaagaattt ttaagcgaat    60

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<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>25

tatcttcgca tcggtgagcc gccatgttcg gttaaatgcc ctactaccca ttcgtcaata    60

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<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>26

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<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>27

attatgaacc aattaaaaaa tgatcgttac ttaaaagcgt tactacgtga accagttgat    60

atgacaccgg tatggatgat gcgtcaagcg gggcgttatc taccggaata taaagcgaca    120

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attaaagccg gcgcgcaagc ggtgatggtg ttcgatactt ggggcggcgt gttggcgcat    660

aacgaatata aagagttctc gctacgttat atgcacaaaa tcgtggacgg tttaattcgt    720

gaaaacgaag gcaga                                                     735

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<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>28

tgcgtggtat ccacacgatg gaacacttat ttgccggctt atgccgtgat catttaaata  60

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<213>胸膜肺炎放线杆菌

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<213>胸膜肺炎放线杆菌

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tagaaaaact ctgaagtcct tgagaatttc cgctcttcgc catagcctgt aacgcttggg    60

tcggcacgtg taataagctg ttggtcagtt tataacttag ctcgttaagg actttttcac    120

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a                                                                  1201

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<213>胸膜肺炎放线杆菌

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agcaaagttt attccaacaa tcaaatctat tgattacgga ctattcatct attgcatttg    60

aaatggcatt tctaggaaaa caaacaatct attaccaatt tgataaagag gaatttagat    120

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<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>32

cgccacgctt atatacaaca accgccaccg tattggataa attcatactg cggctgtctt    60

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<213>胸膜肺炎放线杆菌

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<213>胸膜肺炎放线杆菌

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<213>胸膜肺炎放线杆菌

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<213>胸膜肺炎放线杆菌

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accg                                                              604

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<213>胸膜肺炎放线杆菌

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<213>胸膜肺炎放线杆菌

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gatatcaagc ctatcaatgg gtgtgtgaag gcaaaatcga taatgttatc gcagtggtcg  180

gtttacaatg gttacaactt aattatcaaa aatatcgagt gtaatgagcg ttttccgata  240

acgacgaata tattttgccc tctttaatga gggcaaattt tttgaagtat             290

<210>55

<211>47

<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>55

cgctcatcac caaacacttg aggttctaag agttttacat ccggaat               47

<210>56

<211>241

<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌

<400>56

cgcacctaga tatcgggata cgcgcggtca attaggcatc tataccgaaa cgggtttatt  60

atcagttcaa aataacgtat taccgcaact tggtaaaaag taatcttgat ctaatgcttt  120

agaaaactta gaattaatca aaagccccat agtttatgct ttggggcttt aattttttca  180

tcagttttta aattaagcgg tcaaaaatta agaatgtttt gcaaatgaaa ttagttgaaa  240

t                                                                  241

<210>57

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>57

cgactacaac ctcaagcta                                                  19

<210>58

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>58

cgaccattct aaccaagc                                                   18

<210>59

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>59

cgccatgtcg accattctaa ccaagctt                                        28

<210>60

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>60

cgcctagtcg actacaacct caagctt                                         27

<210>61

<211>9

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>61

gtcgaccct                                                              9

<210>62

<211>9

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>synthetic ol igonucleotide

<400>62

gtcgacagg                                                              9

<210>63

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>63

gacaagatgt gtatccacc                                                  19