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酶联免疫体外诊断试剂中显色剂的制备

阅读：1110发布：2020-06-14

IPRDB可以提供酶联免疫体外诊断试剂中显色剂的制备专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种酶联免疫体外诊断试剂中显色剂的制备方法。本发明方法改变了酶联免疫体外诊断试剂中显色剂的组成，使整个配制过程简化，提高了显色灵敏度，增加了显色剂的稳定性，并降低了显色背景。有较大的临床应用价值。，下面是酶联免疫体外诊断试剂中显色剂的制备专利的具体信息内容。

1、一种酶联免疫体外诊断试剂中显色剂的制备方法，其特征在于 该方法包括下列步骤：(1)配制0.01-0.1M Tris-HCl或柠檬酸-乙酸钠缓冲液，pH值为 2.0～5.0；

(2)在该缓冲系统中加入乙二胺四乙酸二钠盐，终浓度为0.06 g/L～0.32g/L，搅拌，使充分溶解；

(3)加入青霉素钠或青霉素钾或氨苄青霉素，终浓度为0.02g/L ～0.1g/L，搅拌，使充分溶解；

(4)加入羟胺，终浓度为0.01ml/L～0.06ml/L，搅拌，使充分溶 解；

(5)加入TMB盐酸盐，终浓度为0.3g/L～2.4g/L，使用时的具体 浓度根据试剂所需灵敏度而定，搅拌，使充分溶解。

2、根据权利要求1所述的一种酶联免疫体外诊断试剂中显色剂的 制备方法，其特征在于该方法制得的显色剂适用于以过氧物为酶促反应 底物的显色系统中。

3、根据权利要求2所述的过氧化物为过氧化氢或过氧化脲，以此 类物质为底物的酶为辣根过氧化物酶。

说明书全文

技术领域：

本发明属于生物体外诊断试剂技术领域。具体涉及一种酶联免疫体 外诊断试剂中显色剂的制备。

背景技术：

酶联免疫检测方法(ELISA)由于具有快速、敏感、简便、易于标准 化等优点，已被广泛应用于抗原、抗体、细胞因子以及生化物质等的检 测。ELISA试剂的检测方法有很多种，但各种方法都离不开酶结合物和 显色剂。在ELISA试剂中应用最广泛的酶是辣根过氧化物酶(HRP)， HRP的底物是过氧化物，如过氧化氢，而该系统的显色剂有多种，目前 最常用的是3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)。相对于其他显色剂来 讲，TMB有许多优点，如不致癌性、稳定性好等。检测时，HRP催化过 氧化物释放出氧，无色的TMB被氧化成蓝色的产物，加入酸性的终止液 终止反应后，蓝色溶液变成橙黄色，在450nm波长有最大吸收峰。通过 测量吸光度，便可定性或定量判断出被检测物的含量。

使用TMB作为显色剂，其制备过程比较复杂。通常的制备方法为， 先将TMB溶于有机溶剂(如二甲基亚砜，二甲基甲酰胺等)中，然后加 热使其充分溶解，配制成浓缩液，再边搅拌边缓慢加入到配制好的缓冲 液中。整个制备过程要避光，不能有沉淀产生，操作比较繁琐。

由于TMB不溶于水，即使用有机溶剂助溶，在水中的溶解度也不高， 配制的浓度不能过高，否则会有沉淀产生，因此制备的显色剂灵敏度不 高。

除了灵敏度外，显色背景也是ELISA试剂的一个很重要的指标，较 高的显色背景不仅使实验结果难以判断，而且容易造成错误的检测结果。 低显色背景是高品质试剂的基本要求。而直接用市售TMB制备的显色剂 往往背景偏高。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究改进酶联 免疫体外诊断试剂中显色剂的制备。

本发明通过改变酶联免疫体外诊断试剂中的显色剂的配方来简化显 色剂的配制过程并提高其灵敏度和改善显色背景。

本发明改变酶联免疫体外诊断试剂中的显色剂的组成，使用3，3’， 5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐(3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidline dihydrochloride，TMB盐酸盐)代替3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)， 使整个配制过程简化。TMB盐酸盐可直接溶解到水溶液中，而不需要使 用有机溶剂助溶。

TMB盐酸盐在水中的溶解度可以达到1％，很容易就可根据试剂需 要配制成浓度较高的溶液，获得较高的灵敏度。而TMB即使使用有机溶 剂助溶在水中的溶解度也比较低，通常在0.1％以下，为了获得稍高的溶 解度，需要增加有机溶剂用量，反过来有机溶剂用量加大又影响了显色 灵敏度。

本发明使用的缓冲液为0.01-0.1M Tris-HCl缓冲液，PH为2.0～5.0， 或其他缓冲系统，如0.01-0.1M柠檬酸-乙酸钠，PH为2.0～5.0，在该 缓冲系统中通过加入EDTA二钠盐，可以增加显色剂的稳定性，使显色 剂的保存期延长。

本发明在显色剂中加入了青霉素钠(或青霉素钾、或氨苄青霉素) 和羟胺来降低显色背景同时增加其稳定性。

本发明提供了一种酶联免疫体外诊断试剂中显色剂的制备方法。

本发明的显色剂制备包括下列步骤：

(1)配制0.01-0.1M Tris-HCl或柠檬酸-乙酸钠缓冲液，pH值为 2.0～5.0；

(2)在该缓冲系统中加入乙二胺四乙酸二钠盐，终浓度为0.06 g/L～0.32g/L，搅拌，使充分溶解；

(3)加入青霉素钠或青霉素钾或氨苄青霉素，终浓度为0.02g/L～0.1 g/L，搅拌，使充分溶解；

(4)加入羟胺，终浓度为0.01ml/L～0.06ml/L，搅拌，使充分溶解；

(5)加入TMB盐酸盐，终浓度为0.3g/L～2.4g/L，使用时的具体浓 度根据试剂所需灵敏度而定，搅拌，使充分溶解。

本发明的显色剂适用于以过氧化物为酶促反应底物的显色系统中。 其中所述的过氧化物为过氧化氢或过氧化脲，以此类物质为底物的酶为 辣根过氧化酶(HRP)。

本发明的有益效果：

(1)使用TMB盐酸盐，显色灵敏度高。

(2)显色背景低。

(3)配制过程简单，去除了传统方法中的有机溶剂溶解和配制浓缩 液的过程，不用加热来进行溶解和稀释。

(4)在试剂盒的保存温度(2～8℃)下，稳定性增加。

本发明显色剂与传统显色剂比较数据

以双抗体夹心ELISA法检测HBsAg为例，在已包被抗体的微孔板中 加入系列稀释的抗原，按照常规反应过程进行试验，分别对比传统显色 剂和本发明显色剂，用2M硫酸溶液终止反应后，在酶标仪上比色，结 果如下：

项目     HBsAg含量     (ng/ml)     传统显色剂     (含TMB 0.04％)     本发明显色剂     (含TMB盐酸盐0.06％)   灵敏度(OD值， λ＝450nm)     0.5     0.150     0.311     1     0.322     0.657     2     0.612     1.196     4     1.157     2.129     8     2.028     3.106 显色背景(100份阴性标本平均 OD值)     0.070     0.050 稳定性(2～8℃保存月数)     9     15

实施例1：

制备1L显色剂，TMB盐酸盐浓度为0.04％：

1、在容量瓶中加入约500ml蒸馏水，再依次加入下列物质，待前一 种溶解后再加入后一种；Tris 2.42g；HCl(36％-38％)2.4ml；EDTA 二纳盐0.186g；青霉素钠0.05g；羟胺0.03ml；TMB盐酸盐0.4g。 待溶解后补足蒸馏水至1L。

2、用HCl调整pH值为2.5。

实施例2：

制备1L显色剂，TMB盐酸盐浓度为0.06％：

1、在容量瓶中加入约500ml蒸馏水，再依次加入下列物质，待前一 种溶解后再加入后一种；Tris 2.42g；HCl(36％-38％)2.4ml；EDTA 二纳盐0.186g；青霉素钠0.05g；羟胺0.03ml；TMB盐酸盐0.6g。 待溶解后补足蒸馏水至1L。

2、用HCl调整pH值为2.5。

实施例3：

用浓度为0.06％TMB盐酸盐溶液为显色剂，检测血清或血浆标本中 的HBsAg。

(1)在已包被抗HBs的微孔板中依次加入标本50ul，同时做两孔 阴性对照、一孔阳性对照、一孔空白对照，然后每孔(除空白对照孔外) 加入抗HBs-HRP酶结合物溶液50ul，置37℃保温30分钟。

(2)弃去孔内液体，用洗涤液洗板5次。

(3)各孔加底物溶液50ul，本发明实施例2制备的显色剂50ul， 置37℃保温15分钟。

(4)各孔加终止液50ul，终止反应。

(5)将反应板置酶标比色计450nm波长处用空白孔校零，读取各 孔OD值。

(6)计算，Cut Off值＝阴性对照平均OD值×2.1，阴性对照平均 OD值小于0.05按0.05计算，大于等于0.05按实际OD值计算。

(7)结果判断：标本OD值大于或等于Cut Off值为阳性，小于Cut Off值为阴性。

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