[0001] 技术领域

[0002] 本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种用基因重组技术构建弱毒活疫苗株并用该毒株生产猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的方法。

[0003] 背景技术

[0004] 猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的以母猪发热、流产，断奶前后仔猪死亡率升高，不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病。1991年，荷兰学者Terpstra等人在感染猪体内分离到欧洲型PRRSV，命名为Lelystad病毒(Lv)；同年，美国学者Benfield等人分离到美洲型PRRSV，命名为VR-2332。近年来，我国学者相继分离鉴定了美洲型PRRSV的CH-1a、S1、HB-1和HB-2等毒株。

[0005] 猪“高热病”是新近在我国发生的重大动物疫病，此前在国内外均无相关研究报道。宁宜宝等经过大量的实验证实了猪蓝耳病病毒感染是导致高热病的主要原因。并首先在国内做了报道。

[0006] 国内外针对传统猪蓝耳病的诊断和疫苗免疫防治技术已有大量研究成果，但这些现有技术不能满足我国新出现的高致病性猪蓝耳病防控需要，必须有针对性地研究专门针对高致病性猪蓝耳病的疫苗产品和鉴别诊断技术。

[0007] 大量的实验数据证明：人工传代致弱的猪蓝耳病活疫苗具有较好的免疫力、免疫期长等优点，但因在一些猪场使用后出现了蓝耳病问题，其安全问题引起了人们的普遍关注。在使用弱毒疫苗时，出于疫苗对猪安全原因的考虑，一般只是建议在发生过猪蓝耳病的区域使用，而不建议在未发生过猪蓝耳病的养殖场使用。在欧盟之所以禁止用活疫苗来预防猪蓝耳病，也是因为曾经在一些猪场使用弱毒活疫苗后爆发了蓝耳病。美国在蓝耳病活疫苗的使用上同样非常谨慎。美洲其他一些国家和亚洲地区各国虽然不反对在猪蓝耳病流行地区使用人工传代致弱的猪蓝耳病活疫苗，但不提倡在未发生猪蓝耳病的猪场使用弱毒疫苗。灭活疫苗由于病原被灭活了，不存在散毒的问题，相对活疫苗来说，安全性要好一些，但是与活疫苗相比，免疫效果差，免疫期也短。在我国高致病性猪蓝耳病灭活疫苗使用的结果证明：在已经发生猪蓝耳病地区，由于猪体本身可能已经感染猪蓝耳病病毒，灭活疫苗免疫后不但起不到防病的作用，反而会引起一定的副反应。在疫苗使用对象上说，和活疫苗不同的是，灭活疫苗最好是在未发生猪蓝耳病的地区使用。

[0008] 和经典的猪蓝耳病不同，高致病性猪蓝耳病是由高变异猪蓝耳病毒株引起的，无论是经典的活疫苗，还是灭活疫苗，均不能预防该病的发生。因此，为了有效预防控制高致病性猪蓝耳病，疫苗研究是当务之急。根据经典株疫苗研究的经验教训，非常有必要开展新型基因工程疫苗的研究。

[0009] 1、猪蓝耳病常规疫苗：

[0010] 随着猪蓝耳病的发现，猪蓝耳病的疫苗研究也就随之开展，尽管大家对现有猪蓝耳病疫苗的免疫效果评价不一。目前国内外已经商品化的猪蓝耳病疫苗有灭活疫苗和弱毒活疫苗两类。基因工程疫苗研究也已出现积极发展的趋势。

[0011] 1.1猪蓝耳病弱毒活疫苗：

[0012] 在经典猪蓝耳病弱毒活疫苗方面，美国Boehringer Ingleheim公司于1995年首次推出商品化减毒疫苗Resp PRRS/ReproTM，已获准用于3～18周龄猪的预防接种。随后多个单位均推出了猪蓝耳病弱毒疫苗。目前西班牙、荷兰、美国和中国已研制出猪蓝耳病弱毒活疫苗并商品化。可供各阶段猪群使用，但主要供3～18周龄的仔猪接种使用，用于防制猪蓝耳病的呼吸障碍。据报道，接种猪蓝耳病弱毒疫苗后第110天用同源强毒攻击，动物可得到完全保护，而且对强毒攻击的保护甚至是终生的。架子猪接种7天后就激发保护性免疫应答，并可持续16周以上，与未接种的对照猪相比，接种猪攻毒后排毒时间减少，肺部病变减轻，生长发育良好。然而，多数报道认为猪蓝耳病弱毒活疫苗存在安全问题。Botner等报道，在丹麦，对1000多头猪蓝耳病血清学阴性猪使用了弱毒疫苗，可是不久后猪群发生了猪蓝耳病，而且从流产胎儿和死胎中分离到了疫苗病毒，发现疫苗病毒可经胎盘感染胎儿，并向未接种的母猪传播，有些猪群则表现出急性猪蓝耳病样综合症状。也有研究者用该疫苗接种公猪，随后以强毒攻击，发现有精液排毒和精液质量下降等现象。

[0013] Opriessnig报道从一个多次接种Ingelvac PRRS MLV的猪场发生猪蓝耳病后分离到一株PRRSV 98-38803，并证实该毒株来自于Ingelvac PRRS MLV。所以猪蓝耳病弱毒疫苗的毒力返强的可能性是存在的。从以上结果来看，猪蓝耳病弱毒疫苗免疫产生期快，在控制猪蓝耳病临床症状上明显好于猪蓝耳病灭活疫苗。但猪蓝耳病强毒和弱毒在猪体内的反应过程是一致的，所以长期使用猪蓝耳病弱毒疫苗所带来的安全问题仍是目前猪蓝耳病免疫中最大的争议。尽管弱毒苗免疫能使猪体获得一定的免疫力，但弱毒疫苗的不安全性尤其是毒力返强等变异可能性是限制了其广泛使用。

[0014] 在高致病蓝耳病减毒活疫苗方面，目前，虽然我国有多家单位在通过细胞传代致弱的方式研究高致病蓝耳病减毒活疫苗，并取得良好的进展，但它们的安全性需要做进一步观察。

[0015] 1.2猪蓝耳病灭活疫苗：

[0016] 在经典猪蓝耳病灭活疫苗方面，Bayer公司于1997年推出了灭活疫苗PRRomiSet M，此后西班牙、荷兰、加拿大和中国都已研制出猪蓝耳病灭活疫苗并商品化。主要用于预防后备母猪和经产母猪感染猪蓝耳病所造成的繁殖障碍。灭活疫苗的优点是安全性好，但主要刺激猪体产生体液免疫反应，对清除感染巨噬细胞中的猪蓝耳病病毒无能为力，因此仅靠灭活苗免疫不能使猪产生牢固的免疫力。灭活疫苗免疫后的缺点是免疫剂量大、免疫次数多、免疫力产生期较长，因而不适合仔猪免疫。据报道，灭活疫苗免疫后攻毒不能保护仔猪对猪蓝耳病病毒的感染，病毒感染后病毒血症的持续时间和病毒的滴度与非免疫组无显著差别。仔猪和架子猪带毒是猪场猪蓝耳病病毒持续存在的最重要原因，因此，通过灭活疫苗难以控制和根除猪蓝耳病病毒在猪场的存在和流行。

[0017] 在高致病蓝耳病灭活疫苗方面，2006年夏季以来，我国部分地区陆续发生猪高致病性蓝耳病疫情，农业部组织了中国动物疫病预防控制中心、中国兽医药品监察所联合研制等有关单位，进行了高致病性蓝耳病灭活疫苗研究，该疫苗于2007年5月正式投产。此疫苗利用流行的高致病性蓝耳病变异毒株NVDC-JXA1株作为种毒，这疫苗是目前唯一获得临时批准文号并作为政府招标采购紧急预防用的灭活疫苗，但使用结果表明：该疫苗存在与其它灭活疫苗同样的问题。

[0018] 目前，我国还有多家单位在研究高致病蓝耳病活疫苗，但它们都在研究之中，尚未投放市场使用。

[0019] 2猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗

[0020] 目前正在实验室研制的猪蓝耳病新型疫苗种类很多，主要有亚单位疫苗、基因工程重组/嵌合疫苗和DNA疫苗，虽然所取得的进展是喜人的，但他们基本都处在研究阶段。

[0021] 2.1亚单位疫苗

[0022] 目前对猪蓝耳病病毒各结构蛋白免疫原性的研究已比较清楚，猪蓝耳病病毒感染猪体后，血清中抗猪蓝耳病病毒的免疫球蛋白主要是针对N蛋白和M蛋白，GP3虽不能刺激中和抗体的产生，但可对仔猪提供保护。GP4、GP5和M蛋白可产生中和抗体，GP5比GP4产生中和抗体的能力更强。亚单位疫苗及其他新型疫苗的研究多针对这些蛋白。

[0023] 2.2基因工程重组疫苗

[0024] Gagnon等通过对GP5及M蛋白等基因进行了重组表达，构建基因工程重组疫苗的研究，为猪蓝耳病新型疫苗的研究开辟了新领域。用猪蓝耳病病毒人工制备重组病毒的工作也已展开，Verheije等构建了猪蓝耳病病毒LV株的感染性cDNA克隆、得到人工突变的猪蓝耳病病毒，并进行了突变株安全性及免疫保护效力进行了检测。目前基因工程重组疫苗可给猪体提供一定的保护，但效果不完全。

[0025] 2.3DNA疫苗

[0026] Kwang、Pirzadeh、中国农业大学杨汉春等制备了分别表达猪蓝耳病病毒ORFK4、ORF5、ORF6及ORF7的DNA疫苗并用于动物试验，表明DNA疫苗可诱导体液免疫和细胞免疫的产生。

[0027] 尽管目前针对PRRS的疫苗研究种类繁多，但没有任何一种疫苗可对猪体产生理想的安全保护作用。

[0028] 猪繁殖与呼吸综合征(或猪蓝耳病)疫苗的研发是一个世界性难题，活疫苗普遍存在毒力偏强的问题，而灭活疫苗存在的主要问题是免疫效力欠佳。目前，世界上尚没有一种满意的疫苗用于该疾病的预防。而2006年在我国出现的高致病性猪蓝耳病，由于病原基因的突变，经典的猪蓝耳病疫苗对其基本上没有免疫保护力，用高致病性猪蓝耳病病毒分离株生产的灭活疫苗同样不能对野毒株产生有效的保护，传代致弱株生产弱毒疫苗同样存在毒力的问题。因此，目前迫切需要研究出一种安全有效，免疫谱广的疫苗。

[0029] 发明内容

[0030] 本发明为了克服上述现有技术存在的问题及缺点，提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合重组疫苗株及其生产活疫苗的方法，本发明利用反向遗传操作和基因重组技术将高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒株基因与经典猪繁殖与呼吸综合征弱毒株基因嵌合，重组成一个新的嵌合弱毒疫苗株和用该毒株生产疫苗，有效地解决此类疫苗存在的上述问题。

[0031] 本发明技术方案为：

[0032] 猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合重组疫苗株，利用反向遗传操作和基因重组技术将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典毒PTK株的GP2基因的后半部分及GP3～GP5基因、M蛋白基因、N蛋白基因及其间隔序列和3’非编码区的所有核苷酸序列全部删除后，替换成中国高致病猪蓝耳病变异毒株的对应基因，重组成一个同时含有猪繁殖与呼吸综合征经典株和变异株基因的嵌合重组疫苗株(PC株)，嵌合重组疫苗株(PC株)的基因全序列总长度为15562bp，嵌合重组疫苗株(PC株)基因的氨基酸序列。该嵌合重组株毒性低，对猪安全，有良好的免疫原性，用PC株生产疫苗可预防猪繁殖与呼吸综合征经典株和变异株的感染。

[0033] 所述的中国高致病猪蓝耳病变异毒株的对应基因为中国高致病性猪蓝耳病变异毒株GP2基因的后半部分、GP3基因、GP4基因、GP5基因、M蛋白基因、N蛋白基因及其间隔序列和3’非编码区的所有核苷酸序列，且嵌入的目的核酸序列总长度为2421bp，主要编码PRRSV的结构蛋白以及3’非编码区。其中GP2基因的后半部分、GP3基因、GP4基因、GP5基因、M蛋白基因、N蛋白基因为病毒的结构蛋白，3’非编码区的核苷酸序列与病毒的复制和活性有关。可通过特异性RT-PCR方法扩增进行检验。嵌入的中国高致病猪蓝耳病变异毒株的对应基因的氨基酸序列。

[0034] 所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合重组疫苗株来生产活疫苗的方法，按以下步骤进行：

[0035] (1)制苗用细胞的传代与培养：将Marc145或MA104细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成致密单层时，备用；用于继续传代或接种病毒；

[0036] (2)细胞毒种的繁殖：将PC株病毒液按1/10的体积量接入已经生长成良好细胞单层的细胞瓶，吸附1小时后，加入细胞维持液于细胞系单层，继续培养，当70-80％细胞出现病变后收获，收获的毒液冻融2-3次后置-15℃以下保存，取少量做半成品检验；

[0037] (3)配苗、分装及冻干：将检验合格的病毒培养液与常规稳定剂按1∶1的体积比在一容器内混合，充分摇匀，定量分装；每头份含细胞毒液不少于105.0TCID50，分装后迅速进行冷冻干燥即得成品。

[0038] 本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合重组疫苗株PC株是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典毒PTK株的ORF1-ORF2基因片段前半部分作载体，插入高致病猪繁殖与呼吸综合征中国分离毒株ORF2基因片段后半部分ORF3-ORF7基因片段，构建成重组嵌合的PC株，载体名称为PB13117质粒。载体的核酸序列包括：PBluescript SK全序列、CMV启动子、T7启动子以及猪繁殖于呼吸综合征病毒(PRRSV)PTK株的基因组序列，PBS13117质粒的CMV启动子T7启动子的大小分别为565bp和19bp。本发明中只使用到T7启动子，终止子为rrnB rRNA操纵子的t1t2串连转录终止子，大小为402bp，CMV启动子来自于巨细胞病毒，T7启动子来源于噬菌体，rrnB终止子来源于大肠杆菌，插入中国高致病性蓝耳病变异株目的核酸序列后，嵌合疫苗毒PC株的基因全序列为15562bp。本发明构建嵌合重组PC株的工艺流程如图1所示。

[0039] 标记基因为氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，基因ORF大小为861bp，其功能为可使含有该基因的细菌具有耐受一定浓度氨苄青霉素的能力，来源于大肠杆菌。

[0040] 基因操作方法：

[0041] 本发明所使用的基因操作方法包括常规的RT-PCR、酶切、连接、转化、体外转录、细胞转染等分子生物学方法。

[0042] 猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合重组疫苗株PC株的转基因微生物的检测方法，采用RT-PCR方法检测。

[0043] 本发明具有以下优点：

[0044] 嵌合重组PC株在细胞上的增殖和遗传稳定性：本发明的嵌合重组PC株在病毒拯救成功后，可在Marc145或MA104细胞内稳定地表达和发挥功能，构建的嵌合毒株在Marc145或MA104细胞上能稳定增殖，连续传代20代以上其各种特性没有发生变化。在本动物体内回传5代，毒力没有返强，遗传性能稳定。

[0045] 疫苗生产和疫苗特性：本发明的嵌合重组PC株对本动物具有良好安全性和免疫原性，故用其生产疫苗，用以预防猪繁殖与呼吸综合征经典毒株和高致病性变异毒株的感染。

[0046] 本发明构建的嵌合重组PC株可在Marc145或MA104细胞上高效增殖，使其产生病变。该毒株毒力低，回传猪5代毒力不返强，遗传性能稳定；具有良好的免疫原性，由于该嵌合重组PC株同时保留了猪繁殖与呼吸综合征经典株和高致病性变异毒株的基因结构，用其制造的疫苗免疫效力高，可同时保护猪蓝耳病经典毒株和高致病性变异毒株的感染。

[0047] 本发明生产的疫苗具有如下几大优点：

[0048] 1、由于遗传背景清楚，疫苗不会出现毒力返强，这可以克服人工传代致弱疫苗安全性的问题。

[0049] 2、由于它是一个活疫苗，既能刺激体液免疫，又能刺激细胞免疫，而且基因没有受到长时间传代的诱变影响，基因结构同原始株更接近。应该具有良好的免疫效果。

[0050] 3、由于疫苗中既含有经典株的部分基因，又含有变异株的部分基因，从理论上讲，它是一个双价疫苗，既可用于预防经典的猪蓝耳病，又可以预防高致病性猪蓝耳病。

[0051] 4、由于在基因构建是可以人工插入表示基因，因而，对该疫苗可以作鉴别诊断。这对评价疫苗的免疫效力和进行疾病根除十分有利，这一点是传统疫苗难以做到的。

[0052] 5、相对长时间病毒在细胞中传代致弱来说，基因工程疫苗构建过程所花费的时间要短得多，得别是我们已经获得了安全载体的前提下。这对我国急需高致病性猪蓝耳病疫苗的情况下，显得特别有意义。

[0053] 附图说明

[0054] 图1为本发明构建嵌合重组PC株的工艺流程图。

[0055] 具体实施方式

[0056] 本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合重组疫苗株，利用反向遗传操作和基因重组技术将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典毒PTK株的GP2基因的后半部分及GP3～GP5基因、M蛋白基因、N蛋白基因及其间隔序列和3’非编码区的所有核苷酸序列全部删除后，替换成中国高致病猪蓝耳病变异毒株的对应基因，重组成一个同时含有猪繁殖与呼吸综合征经典株和变异株基因的嵌合重组疫苗株(PC株)，所述的中国高致病猪蓝耳病变异毒株的对应基因为中国高致病性猪蓝耳病变异毒株GP2基因的后半部分、GP3基因、GP4基因、GP5基因、M蛋白基因、N蛋白基因及其间隔序列和3’非编码区的所有核苷酸序列，且插入的目的核酸序列总长度为2421bp，主要编码PRRSV的结构蛋白以及3’非编码区。

[0057] 所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合重组疫苗株来生产活疫苗的方法，按以下步骤进行：

[0058] (1)制苗用细胞的传代与培养：将Marc145细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，备用；用于继续传代或接种病毒；

[0059] (2)细胞毒种的繁殖：将PC株病毒液按1/10的体积量接入已经生长成良好细胞单层的细胞瓶，吸附1小时后，加入细胞维持液于细胞系单层，继续培养，当70-80％细胞出现病变后收获，收获的毒液冻融2-3次后置-15℃以下保存，取少量做半成品检验；

[0060] (3)配苗、分装及冻干：将检验合格的病毒培养液，与常规稳定剂按1∶1的体积比在一容器内混合，充分摇匀，定量分装；每头份含细胞毒液不少于105.0TCID50，分装后迅速进行冷冻干燥即得成品。

[0061] 本发明生产的疫苗株在细胞上的特性：以PB13117质粒为载体，插入中国高致病性猪蓝耳病病毒GD株ORF2后半部分和ORF3～ORF7核酸序列后重新获得的嵌合疫苗毒PC株，可在Marc145细胞内稳定地增殖，使细胞在72小时左右产生拉网式病变，在细胞上连续传代20代，病毒的增殖特性没有发生变化，基因结构没有发生变化。

[0062] 一、疫苗对本动物的安全性：

[0063] 1、猪蓝耳病重组疫苗(第4代)(TCID50＝105.25)分别感染33日龄10头健康仔猪，感染剂量为3ml/头猪，滴鼻2ml，颈部肌肉注射1ml，感染后每天上下午各测1次体温，观察临床症状，30日后，取5头宰杀后解剖观测其肺脏及其他器官的变化。

[0064] 结果所有10头猪均无体温升高，全部猪健活。解剖的5头猪所有内脏器官无肉眼可见病理变化。

[0065] 2、用猪蓝耳病重组疫苗(第5代)(TCID50＝105.0)分别感染35日龄5头健康仔猪，感染剂量为3ml/头猪，滴鼻2ml，颈部肌肉注射1ml，感染后每天上下午各测1次体温，观察临床症状，21日后，全部宰杀后解剖观测其肺脏及其他器官的变化。

[0066] 结果所有5头猪均无体温升高，全部猪健活。解剖的5头猪所有内脏器官无肉眼可见病理变化

[0067] 3、毒力返强能力。

[0068] 将PRRSV PC株在猪体内连续回传5代，没有发现现毒力返强现象。

[0069] 结果表明：用猪蓝耳病重组疫苗对猪安全。

[0070] 二、猪蓝耳病PC株疫苗效力试验：

[0071] 1、使用猪蓝耳病重组疫苗(PC株第4代)(TCID50＝105.25)免疫15头健康仔猪，35日后攻毒，攻毒后观察21天，宰杀后解剖观测其肺脏及其他器官的变化。试验结果如下：

[0072] 安全性：所有免疫猪在疫苗接种后的35日内，均无体温上升。也无临床症状。证明疫苗安全。

[0073] 免疫保护：免疫后14天抗体检测100％阳性；攻击强毒后，所有免疫猪均健活，三组免疫猪的体重增加明显高于对照猪。免疫猪的肺部病变保护率为78％。

[0074] 2、使用两组猪蓝耳病重组疫苗(PC株第5代)(TCID50＝105.25)，5倍稀释后，每批各免疫5头36日龄健康仔猪，颈部肌肉注射1ml/头，21日后，连同对照5头一起攻毒，每头点鼻0.5ml，颈部肌肉注射2ml。每天测温，观察临床症状，21天宰杀后解剖观测其肺脏及其他器官的变化。结果如下。

[0075] 免疫猪一组2/5发病，1/5死亡，另一组1/5发病，0/5死亡，对照猪5/5发病，4/5死亡。

[0076] 结果表明：用猪蓝耳病重组疫苗免疫猪可产生良好的保护效果。附件1：
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附件2：
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