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多重PCR检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型的方法

阅读：495发布：2021-02-22

IPRDB可以提供多重PCR检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种运用多重PCR技术检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型的方法，主要的技术方案是设计引物序列并对多重PCR反应体系及反应条件进行优化。金黄色葡萄球菌的肠毒素和侵袭性酶影响了金葡菌致病力强弱，现已鉴定出的肠毒素有A、B、C1-C3、D、E、G、H、I、J、L、M、N共14种。一般说来，食物中毒时A、D型常见，B、C型次之，涉及到E毒素的发生率最低，各肠毒素毒力不一，其中A型毒素毒力较强，D型较弱。针对金葡菌常见肠毒素基因型，本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种运用多重PCR技术检测食品中金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型的方法。该方法可在同一反应体系中，同时检测出产A、B、C、D型肠毒素的金黄色葡萄球菌。，下面是多重PCR检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1. 一种多重PCR检测食品中金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型的方法，包括：应用该方法检测食源性病原微生物所使用的引物组和与之配套的PCR反应条件，其特征在于：所使用的引物组序列如下：引物编号引物序列（5ˊ-3ˊ）预期扩增大小SEA-1 CGGCACTTTTTTCTCTTCGG 102bpSEA-2 GGTTATCAATGTGCGGGTGGSEB-1 TCTTTGTCGTAAGATAAACTTC 416bpSEB-2 GAATGATATTAATTCGCATCSEC-1 ATCATACCAAAAAGTATTGC 501bpSEC-2 GTATCAGCAACTAAAGTTATSED-1 TCAATTCAAAAGAAATGGCTCA 339bpSED-2 TTTTTCCGCGCTGTATTTTTnuc-1 AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC 279bpnuc-2 GCGATTGATGGTGATACGGTT ；

多重PCR扩增程序及测定扩增片段的溶解温度程序如下：（1）预变性：94℃，5min；

（2）变性：94℃，45s；

（3）退火：57.8℃，35s；

（4）延伸：72℃，45s；

（5）回到（2）共30个循环；

（6）72℃延伸7min。

2.根据权利要求1所述的多重PCR检测食品中金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型的方法，其特征在于：多重PCR反应体系中各组分构成比例如下：组成浓度用量（μL）

Mg 12.5m M 10

10×PCR Buffer 2SEA-1 0.1μg/μL 0.3SEA-2 0.1μg/μL 0.3SEB-1 0.1μg/μL 0.4SEB-2 0.1μg/μL 0.4SEC-1 0.1μg/μL 0.5SEC-2 0.1μg/μL 0.5SED-1 0.1μg/μL 0.3SED-2 0.1μg/μL 0.3nuc-1 0.1μg/μL 0.3nuc-2 0.1μg/μL 0.3Template DNA 2Taq 5U/μL 0.2dNTPs 2.5mM 1.8ddH2O 0.4总体积 20μL 。

说明书全文

多重PCR检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及细菌检验技术，具体地说是运用多重PCR技术来检测食品中金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型，特别是食源性病原微生物的技术。

背景技术

[0002] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属（Staphylococcus），可引起多种严重感染。在显微镜下排列成葡萄串状，直径0.8um左右。无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性，易与其他细菌区分。同时它的营养要求较低，在需氧或兼性厌氧的条件下均可生长，最适生长温度37℃，最适生长pH 7.4。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶，现已鉴定出的肠毒素有A、B、C1-C3（根据等电点不同将C分为三种类型）、D、E、G、H、I、J、L、M、N共14种，一般说来，食物中毒时A、D型常见，B、C型次之，涉及到E毒素的发生率最低，各肠毒素毒力不一，其中A型毒素毒力较强，D型较弱。

[0003] 目前，随着科学技术的快速发展，分子技术尤其是多重PCR技术在食品检测领域中发挥了重要的作用。目前国内外研究的多重PCR方法主要有NARESH K. SHARMA等人建立的一种多重PCR检测肠毒素A～E，利用了几种毒素基因的通用保守序列及特异序列，即一个相同的上游引物及特异性下游引物，可在3～4h内检测出毒素基因A～E，且与标准的免疫检测有近99%的对应性（Sharma，2000）；利用16sRNA和23sRNA间的间隔序列DNA做为模板，由于其被认为是非功能性片段，因此其变异性比16sDNA高10倍，可以有效地区分种间差异，P. Phuektes等人利用该序列进行的多重PCR可以同时鉴别四种乳房炎病菌：S. aureus，S. agalactiae，S. dysgalactiae和S. uberis（P. Phuektes，2001）。更有甚者，通过两个PCR反应体系、两对引物同时检测了包括肠毒素SE、TSST-1、Ets、mecA在内的十种毒素基因，且效果很好，有很好的应用前景（Mehrotra，2000）。国内学者对于肠毒素的研究主要运用在对致病菌的快速检测中。杨小娟等对沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌三种食源性致病菌建立多重PCR检测技术，分别以沙门氏菌invA基因、副溶血性弧菌taxR基因和单核细胞增生性李斯特氏菌iap基因为靶基因，建立并优化了同时检测水产品中这3种致病菌的多重PCR体系，扩增产物分别为495bp（invA）、368bp（taxR）和660bp（iap）。建立的多重PCR方法可以简便、快速、灵敏地实现水产品中沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌的同时检测，人工污染水产品检测限为
10cfu/mL。为无公害水产品食源性致病菌的快速检测提供了理想手段，有良好的应用前景（杨小娟，2008）。

[0004] 但是目前还没有专门用多重PCR方法针对金黄色葡萄球菌常见的肠毒素基因型进行研究，而且没有内部对照。中国专利公开号CN101113472A、申请号200710057579.5公开了《运用复合荧光PCR技术检测食源性病源微生物的方法》，也与本实验的多重PCR技术不是一个概念，技术原理不一样。

发明内容

[0005] 针对金葡菌常见肠毒素基因型，本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种运用多重PCR技术检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型的方法。该方法可在同一反应体系中，同时检测出产A、B、C、D型肠毒素的金黄色葡萄球菌。

[0006] 该方法包括：应用该方法检测食源性病原微生物所使用的引物组和与之配套的PCR反应条件，引物序列如下表1：

[0007] 表1各引物序列

[0008]

[0009] 同时，本发明还提供了更加准确和低成本通过多重PCR技术检测食品中金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型的方法。

[0010] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0011] （1）设计各肠毒素基因型的特异性引物用于多重PCR技术检测；

[0012] （2）整合各引物使之不互相干扰；

[0013] （3）以引物系列组，扩增待测样品模板，进行目的基因的特异性扩增；

[0014] （4）扩增过程在PCR仪上进行并在PCR反应结束后将所合成DNA片段进行电泳及观察结果。

[0015] 本发明中用特异性引物检测产A、B、C、D型肠毒素的金黄色葡萄球菌，同时以大肠杆菌、沙门氏菌、嗜热链球菌、志贺氏菌及枯草芽孢杆菌作对照，结果显示所设计的引物组特异性较好。

[0016] 本发明中多重PCR反应体系中各组分构成如下表2（20uL体积）：

[0017] 表2多重PCR反应体系

[0018]

[0019] 多重PCR扩增程序为：

[0020] （1）预变性：94℃，5min；

[0021] （2）变性：94℃，45s；

[0022] （3）退火：57.8℃，35s；

[0023] （4）延伸：72℃，45s；

[0024] （5）回到（2）共30个循环。

[0025] （6）72℃延伸7min。

[0026] 多重PCR的扩增过程在PCR仪上进行，并在PCR反应结束后将所合成DNA片段进行电泳及观察结果。在凝胶成像仪传输给电脑的图片中，如果在102bp、279bp、339bp、416bp及501bp处有特异性条带，则证明所检样品中存在产相应肠毒素基因型的金葡菌。

[0027] 与现有的技术相比，本发明的有益效果是：多重PCR方法适用于直接从食品中提取总DNA，扩增靶基因，而且本使用方法可一次性同时扩增出金葡菌A、B、C、D型基因，同时还有金葡菌特有的nuc（耐热核酸酶）基因做内部的阳性对照。本发明能够节约检测时间和成本，同时具有准确性好、特异性强、灵敏度高的特点。较生理生化的检测方法有很大的优越性。

[0028] 因为目前还没有专门用多重PCR方法针对金黄色葡萄球菌常见的肠毒素基因型进行研究，而且没有内部对照。本发明主要研究了金黄色葡萄球菌常见的肠毒素A、B、C、D基因型，并在反应体系中加入了nuc基因进行对照，从而弥补了这一不足。本发明主要是检测金葡菌及其肠毒素基因型。因为金葡菌是导致奶牛患乳房炎的主要因素，同时在被金葡菌污染的奶粉、猪肉、糕点中易产生肠毒素，从而引起恶心、呕吐等不良反应。本发明的目的就是能够检测出食品中的金葡菌，并同时检测出是产哪种肠毒素基因型的金葡菌，可以说是上述“200710057579.5”的《运用复合荧光PCR技术检测食源性病源微生物的方法》一个深度延伸。

附图说明

[0029] 图1 某待测原料乳样品中多重PCR技术检测待测样品中的金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型。

[0030] 图中：原料乳样品多重PCR结果

[0031] M：2000bp Marker 1：阳性对照；2：a；3：b；4：c；5：d；6：e；7：f；8：g；9：h。

[0032] 图2 多重PCR技术检测各已知产肠毒素基因型金黄色葡萄球菌标准菌株污染的市售奶粉中金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型

[0033] 图中：奶粉多重PCR结果

[0034] M：2000bp Marker；1：阳性对照；2：产A型肠毒素金葡菌标准菌株；3：产B型肠毒素金葡菌标准菌株；4：产C型肠毒素金葡菌标准菌株；5：产D型肠毒素金葡菌标准菌株6：未污染的市售奶粉。

[0035] 图3 多重PCR技术检测各已知产肠毒素基因型金黄色葡萄球菌标准菌株污染的市售猪肉中金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型

[0036] 图中：猪肉多重PCR结果

[0037] M：2000bp Marker；1：阳性对照；2：产A型肠毒素金葡菌标准菌株；3：产B型肠毒素金葡菌标准菌株；4：产C型肠毒素金葡菌标准菌株；5：产D型肠毒素金葡菌标准菌株6：未污染的市售猪肉。

[0038] 图4 多重PCR技术检测各已知产肠毒素基因型金黄色葡萄球菌标准菌株污染的市售糕点中金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型

[0039] 图中：糕点多重PCR结果

[0040] M：2000bp Marker；1：阳性对照；2：产A型肠毒素金葡菌标准菌株；3：产B型肠毒素金葡菌标准菌株；4：产C型肠毒素金葡菌标准菌株；5：产D型肠毒素金葡菌标准菌株6：未污染的市售糕点。

具体实施方式

[0041] 下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步描述。

[0042] 实施例1

[0043] 样品：某奶牛场原料乳样

[0044] 对采集于奶牛场的乳样进行检测，分别标号为a、b、c、d、e、f、g、h。其中a、b、c为乳房炎乳样，d、e、f、g是随机抽取奶牛的乳样，h是牛乳倒入冷却罐后的综合样。

[0045] 1、样品处理

[0046] （1）取1mL原料乳，分别取200uL无水乙醇、200uL石油醚（或乙醚）和200uL丙酮加入其中，混匀，将混合物以12000rpm离心10min。

[0047] （2）弃去上清液，剩余的沉淀用300uL TE（pH8.0）溶解，加入10uL（50mg/mL）的溶菌酶溶液，37℃温育1h。

[0048] 2、DNA提取

[0049] 使用细菌基因组DNA提取试剂盒对原料乳中细菌的总DNA进行提取（对部分步骤进行了改进），将所提取DNA溶于84uL 1×TE buffer缓冲溶液中，即得DNA模板。

[0050] （1）将细菌培养12h，取细菌培养液1mL，10000rpm离心1min，弃去上清液。

[0051] （2）向菌体沉淀中加入50mg/mL的溶菌酶溶液180uL，充分混匀，37℃水浴30min，期间，每隔10min混匀一次。

[0052] （3）向管中加入200uL缓冲液GA，反复混匀2min，65℃水浴10min，期间，每隔数分钟混匀一次。

[0053] （4）加入20uL蛋白酶K溶液，充分混匀，70℃水浴20min。

[0054] （5）加入220uL缓冲液GB，振荡15s，70℃水浴40min，此时，溶液应变清亮，短暂离心以去除管盖内壁的水珠。

[0055] （6）加入220uL无水乙醇，振荡15s，此时可能会出现絮状沉淀，短暂离心。

[0056] （7）将所得的溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3中（吸附柱放在收集管中），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

[0057] （8）向吸附柱CB3中加入500uL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

[0058] （9）向吸附柱CB3中加入700uL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

[0059] （10）向吸附柱CB3中加入500uL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

[0060] （11）将放入收集管中的吸附柱CB3，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于37℃温箱或室温放置，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

[0061] （12）将吸附柱CB3放入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加84uL洗脱液TE，室温放置2～5min，12000rpm离心2min。

[0062] （13）将离心所得溶液分装，每6uL一管。取5uL 基因组DNA与1uL 6×loading buffer 混匀，用1.0%琼脂糖凝胶，100v、50min电泳检测后，-20℃条件下贮藏。

[0063] 3、PCR扩增

[0064] 本发明中多重PCR反应体系中各组分构成如下表2（20uL体积）：

[0065] 表2多重PCR反应体系

[0066]

[0067] 多重PCR扩增程序为：

[0068] （1）预变性：94℃，5min；

[0069] （2）变性：94℃，45s；

[0070] （3）退火：57.8℃，35s；

[0071] （4）延伸：72℃，45s；

[0072] （5）回到（2）共30个循环。

[0073] （6）72℃延伸7min。

[0074] PCR共进行9管PCR实验，其中DNA样品所加入的分别为：加入产A、B、C、D型肠毒素的金葡菌标准菌株总DNA；本待测样品DNA。

[0075] 4、被检测样品多重PCR图片观察

[0076] 结果如图1所示，阳性对照中在102bp、279bp、339bp、416bp及501bp处有特异性条带；待测样品中正常乳及综合乳样没有特异性条带，乳房炎乳在102bp处有特异性条带。

[0077] 实验表明所采样品中正常乳及综合乳样中没有金葡菌，乳房炎乳样中含有产A型肠毒素的金葡菌。

[0078] 实施例2

[0079] 样品：某市售奶粉

[0080] 将购买的某市售奶粉进行检测，在人工污染金黄色葡萄球菌前，产品做灭菌处理，并按国标法检测证实不含有金黄色葡萄球菌。将产A、B、C、D的金葡菌标准菌株人工污染到奶粉中，即取25g样品加入225mL缓冲蛋白胨水中均质混匀，然后对均质液人工污染。37℃震荡培养12h。

[0081] 1、样品处理

[0082] （1）取2mL乳液，分别取200uL无水乙醇、200uL石油醚（或乙醚）和200uL丙酮加入其中，混匀，将混合物以12000rpm离心10min。

[0083] （2）弃去上清液，剩余的沉淀用300uL TE（pH8.0）溶解，加入10uL（50mg/mL）的溶菌酶溶液，37℃温育1h。

[0084] 2、DNA提取

[0085] 使用细菌基因组DNA提取试剂盒对原料乳中细菌的总DNA进行提取（对部分步骤进行了改进），将所提取DNA溶于48uL 1×TE buffer缓冲溶液中，即得DNA模板。

[0086] （1）将细菌培养12h，取细菌培养液1mL，10000rpm离心1min，弃去上清液。

[0087] （2）向菌体沉淀中加入50mg/mL的溶菌酶溶液180uL，充分混匀，37℃水浴30min，期间，每隔10min混匀一次。

[0088] （3）向管中加入200uL缓冲液GA，反复混匀2min，65℃水浴10min，期间，每隔数分钟混匀一次。

[0089] （4）加入20uL蛋白酶K溶液，充分混匀，70℃水浴20min。

[0090] （5）加入220uL缓冲液GB，振荡15s，70℃水浴40min，此时，溶液应变清亮，短暂离心以去除管盖内壁的水珠。

[0091] （6）加入220uL无水乙醇，振荡15s，此时可能会出现絮状沉淀，短暂离心。

[0092] （7）将所得的溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3中（吸附柱放在收集管中），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

[0093] （8）向吸附柱CB3中加入500uL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

[0094] （9）向吸附柱CB3中加入700uL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

[0095] （10）向吸附柱CB3中加入500uL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

[0096] （11）将放入收集管中的吸附柱CB3，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于37℃温箱或室温放置，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

[0097] （12）将吸附柱CB3放入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加84uL洗脱液TE，室温放置2～5min，12000rpm离心2min。

[0098] （13）将离心所得溶液分装，每6uL一管。取5uL 基因组DNA与1uL 6×loading buffer 混匀，用1.0%琼脂糖凝胶，100v、50min电泳检测后，-20℃条件下贮藏。

[0099] 3、PCR扩增

[0100] 本发明中多重PCR反应体系中各组分构成如下表2（20uL体积）：

[0101] 表2多重PCR反应体系

[0102]

[0103] 多重PCR扩增程序为：

[0104] （1）预变性：94℃，5min；

[0105] （2）变性：94℃，45s；

[0106] （3）退火：57.8℃，35s；

[0107] （4）延伸：72℃，45s；

[0108] （5）回到（2）共30个循环。

[0109] （6）72℃延伸7min。

[0110] PCR共进行6管PCR实验，其中DNA样品所加入的分别为：加入产A、B、C、D型肠毒素的金葡菌标准菌株总DNA；本待测样品DNA。

[0111] 4、被检测样品多重PCR图片观察

[0112] 结果如图2所示，阳性对照中在102bp、279bp、339bp、416bp及501bp处有特异性条带；市售乳样阴性对照没有特异性条带；用产A型肠毒素的金葡菌标准菌株污染的牛乳在102bp和279bp处有特异性条带；用产B型肠毒素的金葡菌标准菌株污染的牛乳在416bp和279bp处有特异性条带；用产C型肠毒素的金葡菌标准菌株污染的牛乳在501bp和279bp处有特异性条带；用含D型肠毒素基因的pET-28a质粒的大肠杆菌污染的牛乳在339bp处有特异性条带。

[0113] 实验表明用已构建的多重PCR方法可以成功检测出奶粉中产A、B、C、D型肠毒素的金葡菌。

[0114] 实施例3

[0115] 样品：某市售猪肉

[0116] 将购买的某市售猪肉进行检测，在人工污染金黄色葡萄球菌前，产品做灭菌处理，并按国标法检测证实不含有金黄色葡萄球菌。将产A、B、C、D的金葡菌标准菌株人工污染到猪肉中，即取25g样品加入225mL缓冲蛋白胨水中均质混匀，然后对均质液人工污染，37℃震荡培养12h。

[0117] 1、样品处理

[0118] 取10mL匀浆液以800rpm离心5min，以去除猪肉而将菌液留在浆液中。吸取上清液加入另一灭菌离心管中以10000rpm离心10min，弃去上清液。

[0119] 2、DNA提取

[0120] 使用细菌基因组DNA提取试剂盒对原料乳中细菌的总DNA进行提取（对部分步骤进行了改进），将所提取DNA溶于84uL 1×TE buffer缓冲溶液中，即得DNA模板。

[0121] （1）向上述处理的菌体沉淀中加入50mg/mL的溶菌酶溶液180uL，充分混匀，37℃水浴30min，期间，每隔10min混匀一次。

[0122] （2）向管中加入200uL缓冲液GA，反复混匀2min，65℃水浴10min，期间，每隔数分钟混匀一次。

[0123] （3）加入20uL蛋白酶K溶液，充分混匀，70℃水浴20min。

[0124] （4）加入220uL缓冲液GB，振荡15s，70℃水浴40min，此时，溶液应变清亮，短暂离心以去除管盖内壁的水珠。

[0125] （5）加入220uL无水乙醇，振荡15s，此时可能会出现絮状沉淀，短暂离心。

[0126] （6）将所得的溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3中（吸附柱放在收集管中），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

[0127] （7）向吸附柱CB3中加入500uL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

[0128] （8）向吸附柱CB3中加入700uL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

[0129] （9）向吸附柱CB3中加入500uL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

[0130] （10）将放入收集管中的吸附柱CB3，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于37℃温箱或室温放置，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

[0131] （11）将吸附柱CB3放入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加84uL洗脱液TE，室温放置2～5min，12000rpm离心2min。

[0132] （12）将离心所得溶液分装，每6uL一管。取5uL 基因组DNA与1uL 6×loading buffer 混匀，用1.0%琼脂糖凝胶，100v、50min电泳检测后，-20℃条件下贮藏。

[0133] 3、PCR扩增

[0134] 本发明中多重PCR反应体系中各组分构成如下表2（20uL体积）：

[0135] 表2多重PCR反应体系

[0136]

[0137] 多重PCR扩增程序为：

[0138] （1）预变性：94℃，5min；

[0139] （2）变性：94℃，45s；

[0140] （3）退火：57.8℃，35s；

[0141] （4）延伸：72℃，45s；

[0142] （5）回到（2）共30个循环。

[0143] （6）72℃延伸7min。

[0144] PCR共进行6管PCR实验，其中DNA样品所加入的分别为：加入产A、B、C、D型肠毒素的金葡菌标准菌株总DNA；本待测样品DNA。

[0145] 4、被检测样品多重PCR图片观察

[0146] 结果如图3所示，阳性对照中在102bp、279bp、339bp、416bp及501bp处有特异性条带；市售乳样阴性对照没有特异性条带；用产A型肠毒素的金葡菌标准菌株污染的牛乳在102bp和279bp处有特异性条带；用产B型肠毒素的金葡菌标准菌株污染的牛乳在416bp和279bp处有特异性条带；用产C型肠毒素的金葡菌标准菌株污染的牛乳在501bp和279bp处有特异性条带；用含D型肠毒素基因的pET-28a质粒的大肠杆菌污染的牛乳在339bp处有特异性条带。

[0147] 实验表明用已构建的多重PCR方法可以成功检测出猪肉中产A、B、C、D型肠毒素的金葡菌。

[0148] 实施例4

[0149] 样品：某市售糕点

[0150] 将购买的某市售糕点进行检测，在人工污染金黄色葡萄球菌前，产品做灭菌处理，并按国标法检测证实不含有金黄色葡萄球菌。将产A、B、C、D的金葡菌标准菌株人工污染到糕点中，即取25g样品加入225mL缓冲蛋白胨水中均质混匀，然后对均质液人工污染，37℃震荡培养12h。

[0151] 1、样品处理

[0152] 取10mL匀浆液以800rpm离心5min，以去除糕点碎末而将菌液留在浆液中。吸取上清液加入另一灭菌离心管中以10000rpm离心10min，弃去上清液。

[0153] 2、DNA提取

[0154] 使用细菌基因组DNA提取试剂盒对原料乳中细菌的总DNA进行提取（对部分步骤进行了改进），将所提取DNA溶于84uL 1×TE buffer缓冲溶液中，即得DNA模板。

[0155] （1）向上述处理的菌体沉淀中加入50mg/mL的溶菌酶溶液180uL，充分混匀，37℃水浴30min，期间，每隔10min混匀一次。

[0156] （2）向管中加入200uL缓冲液GA，反复混匀2min，65℃水浴10min，期间，每隔数分钟混匀一次。

[0157] （3）加入20uL蛋白酶K溶液，充分混匀，70℃水浴20min。

[0158] （4）加入220uL缓冲液GB，振荡15s，70℃水浴40min，此时，溶液应变清亮，短暂离心以去除管盖内壁的水珠。

[0159] （5）加入220uL无水乙醇，振荡15s，此时可能会出现絮状沉淀，短暂离心。

[0160] （6）将所得的溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3中（吸附柱放在收集管中），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

[0161] （7）向吸附柱CB3中加入500uL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

[0162] （8）向吸附柱CB3中加入700uL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

[0163] （9）向吸附柱CB3中加入500uL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

[0164] （10）将放入收集管中的吸附柱CB3，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于37℃温箱或室温放置，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

[0165] （11）将吸附柱CB3放入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加84uL洗脱液TE，室温放置2～5min，12000rpm离心2min。

[0166] （12）将离心所得溶液分装，每6uL一管。取5uL 基因组DNA与1uL 6×loading buffer 混匀，用1.0%琼脂糖凝胶，100v、50min电泳检测后，-20℃条件下贮藏。

[0167] 3、PCR扩增

[0168] 本发明中多重PCR反应体系中各组分构成如下表2（20uL体积）：

[0169] 表2多重PCR反应体系

[0170]

[0171] 多重PCR扩增程序为：

[0172] （1）预变性：94℃，5min；

[0173] （2）变性：94℃，45s；

[0174] （3）退火：57.8℃，35s；

[0175] （4）延伸：72℃，45s；

[0176] （5）回到（2）共30个循环。

[0177] （6）72℃延伸7min。

[0178] PCR共进行6管PCR实验，其中DNA样品所加入的分别为：加入产A、B、C、D型肠毒素的金葡菌标准菌株总DNA；本待测样品DNA。

[0179] 4、被检测样品多重PCR图片观察

[0180] 结果如图4所示，阳性对照中在102bp、279bp、339bp、416bp及501bp处有特异性条带；市售乳样阴性对照没有特异性条带；用产A型肠毒素的金葡菌标准菌株污染的牛乳在102bp和279bp处有特异性条带；用产B型肠毒素的金葡菌标准菌株污染的牛乳在416bp和279bp处有特异性条带；用产C型肠毒素的金葡菌标准菌株污染的牛乳在501bp和279bp处有特异性条带；用含D型肠毒素基因的pET-28a质粒的大肠杆菌污染的牛乳在339bp处有特异性条带。

[0181] 实验表明用已构建的多重PCR方法可以成功检测出糕点中的产A、B、C、D型肠毒素金葡菌。

标题	发布/更新时间	阅读量
细菌毒力因子及其用途-专利编号CN101711861A	2020-05-13	485
细菌毒力基因-专利编号CN1735689A	2020-05-11	1127
捕食螨毒力测定方法-专利编号CN104165972A	2020-05-12	665
捕食螨毒力测定方法-专利编号CN104165972B	2020-05-11	952
降低细菌的毒力的方法-专利编号CN102883602A	2020-05-11	946
细菌毒力因子及其用途-专利编号CN1922324B	2020-05-13	740
降低细菌的毒力的方法-专利编号CN102883602B	2020-05-12	966
细菌毒力因子及其用途-专利编号CN1922324A	2020-05-12	225
叶螨毒力测定实验装置-专利编号CN108469497A	2020-05-11	274
捕食螨毒力测定装置-专利编号CN204154697U	2020-05-13	1040

多重PCR检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型的方法

多重PCR检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型的方法

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