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一种猪链球菌2型双基因缺失活疫苗及应用

阅读：635发布：2021-02-23

IPRDB可以提供一种猪链球菌2型双基因缺失活疫苗及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及动物传染病疫苗制备技术领域。具体涉及一种猪链球菌2型双基因缺失活疫苗的制备及应用。本发明以猪链球菌2型地方分离株SC19为基础，采用同源重组的方法，在缺失了单基因Ece1的基础上，继续缺失另一个Salk/R基因，获得猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失株，以该双基因缺失株的菌液和明胶为主要材料制备出猪链球菌2型双基因缺失活疫苗。本发明涉及的猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2010360。本发明制备的猪链球菌2型双基因缺失活疫苗中的Salk/R基因缺失后其毒力大幅度下降，安全性高，不存在毒力返强的风险，且免疫原性高，能够保护免疫猪抵抗5×LD50猪链球菌2型强毒菌株的攻击。，下面是一种猪链球菌2型双基因缺失活疫苗及应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种猪链球菌2型双基因缺失菌株，其特征在于：所述的猪链球菌2型双基因缺失菌株是猪链球菌II型(streptococcus suisII)ΔEcel/ΔSalk/R，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2010360，该菌株在缺失了单基因Ecel的基础上，继续缺失另一个Salk/R基因，构成双基因缺失株，其缺失的第一个基因Ecel的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其缺失的第二个基因Salk/R的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：

2所示。

2.由权利要求1所述的猪链球菌2型双基因缺失菌株制备的猪链球菌2型双基因缺失活疫苗。

3.权利要求1所述的菌株在制备猪链球菌2型双基因缺失活疫苗中的应用。

说明书全文

一种猪链球菌2型双基因缺失活疫苗及应用

技术领域

[0001] 本发明属于动物基因工程技术领域。涉及基因疫苗技术领域，本发明具体涉及一个猪链球菌2型双基因缺失疫苗株的构建，疫苗制备及应用。

背景技术

[0002] 猪链球菌2型(Streptococcus suis Serotype 2，简称SS2)引起的猪链球菌病是一种重要的人畜共患传染病，该病广泛分布于世界各养猪国家，不仅给养猪业造成了巨大的经济损失，同时给人类的健康也造成了极大的威胁(Lun ZR，et al.Streptococcus suis：an emerging zoonoticpathogen.Lancet Infect Dis，2007，7：201-209)。在我国，由猪链球菌2型引起的猪链球菌病也广泛存在，并且近几年有逐渐增多的趋势，目前在我国已成为分布最广、危害最严重的一种猪链球菌病。1998年，我国江苏南通地区发生的猪链球菌2型引起的链球菌病造成25人感染，14人死亡(姚火春等.猪链球菌1998分离株病原特性鉴定.南京农业大学学报，1999，02：67-70)。2005年7、8月间，我国四川资阳地区发生的猪链球菌2型引起的链球菌病导致215人感染，38人死亡(Tang J，et al.Streptococcal toxic shock syndrome caused by Streptococcus suisserotype 2.PLoS Med，2006，3：668-676)，不仅给我国的养猪业造成巨大冲击，而且给公共卫生带来严重威胁，同时给人们的心理也造成了巨大的压力。

[0003] 猪链球菌病的防治主要通过疫苗接种与抗生素的使用，但抗生素的长期使用会导致抗药性菌株的出现，从而影响防治的效果，此外还会引起药物残留及食品安全等方面的问题。同时对于传染病来讲，预防比治疗更为重要、更为有效，也更加经济。目前临床上主要通过灭活疫苗来进行免疫预防(何孔旺等.猪链球菌疫苗研究进展.兽医导刊，2009，08：21-22)，但灭活疫苗对猪只难以提供完全的保护，并且生产成本高，副作用大，严重影响了其发展应用(HOLT ME，et al.Immunization of pigs with killed cultures of Streptococcus suis type 2.Res VetSci 1990，48：23-27；Quessy S，et al.Immunization of mice against Streptococcus suis type 2infection using a live avirulent strain.Can J Vet Res，1994，58：299-301)。随着猪链球菌病流行的日益严重，针对猪链球菌尤其是影响与危害最大的猪链球菌2型，开展新型、安全、有效的疫苗研究成为当务之急。

[0004] 细菌的致病过程是细菌与宿主细胞相互作用的复杂过程，需要多种毒力因子的协调作用。在此过程中，致病菌依靠复杂而精密的信号系统来感受、传导和响应外界环境的变化，进而调节相应的基因表达模式以做出适应性反应，包括下调非必需基因的表达，上调表达在宿主体内存活和致病过程中起关键作用的基因(徐建国.分子医学细菌学，科学出版社.2000，179-196.)。当病原菌入侵宿主体内时，环境中各种营养物质的含量、温度、渗透压和pH值等都发生了改变；另外，一些毒性物质也出现在其生存的环境中(Smith H E，et al.Environmentally regulated genes of Streptococcus suis：identification by the use of iron-restrictedconditions in vitro and by experimental infection of piglets.Microbiology，2001，147：271-280；Huang YT，et al.Streptococcus suis infection.J Microbiology，Immunology and Infection，2005，58：306-313)。环境因素的改变必然会对病原菌的生存产生巨大的压力，而病原菌为了及时正确地捕捉环境中各种理化因素的变化，并据此迅速调节自身的结构和生理行为，达到适应新环境和生存繁殖的目的，就必须有一套特有的对外部环境持续监控的信号系统。目前认为二元信号转导系统(TCS)和密度感应(quorum sensing)系统起着主要的作用。二元信号转导系统是在细菌中普遍存在的一种跨膜信号转导系统，它在细菌感受外界环境变化并做出适应性反应的过程中起着非常重要的作用(Alexander Y，et al.Signal integration in bacterial two-componentregulatory systems.Genes，2008，5：2601-2611)。最简单的TCS由两种蛋白质成分组成，其一为组氨酸激酶(histidine kinase，HK)，通常位于细胞膜上，其功能是识别并翻译外界的环境信号；另一为位于胞浆内的反应调控因子(response regulator，RR)，主要功能是调节某些基因的表达或改变细菌的某种局部运动形式以响应外界信号(Ba-Thein W，et al.The virR/virS locusregulates the transcription of genes encoding extracellular toxin production in Clostridiumperfringens.J Bacteriol，1996，178：2514-2520)。猪链球菌2型二元信号转导系统Salk/SalR是猪链球菌2型强毒株05ZYH33潜在的89K毒力岛上的一对二元信号转导系统，其与介导细菌分泌的salivaricin(一种细菌素)有关(Tang J，et al.Streptococcal toxic shock syndrome caused byStreptococcus suis serotype 2.PLoS Med，2006，3：668-676)。

[0005] 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室谭臣博士(谭臣，猪链球菌2型Ece1的致病性及6PGD蛋白的免疫原性研究，中国知网，2010，http://epub.cnki.net/grid2008/detail.aspx？QueryID＝3&CurRec＝1)已经成功的构建了猪链球菌2型ΔEce1单基因缺失菌株，各种生物学实验数据表明其毒力下降明显，但仍有一定的残余毒力，为了获得安全性更高的猪链球菌2型双基因缺失突变株，申请人以猪链球菌2型ΔEce1单基因缺失菌株为亲本菌株，采用同源重组的方法缺失Salk/R基因，获得猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株，生物学实验证实所获得的猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株遗传性能稳定、安全性高、免疫原性良好。进一步研制成猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失活疫苗，并对其安全性、免疫剂量、接种途径和免疫原性进行了评价，各项评价结果显示该猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失活疫苗可以作为一种防治猪链球菌病的良好疫苗。

发明内容

[0006] 本发明的第一个目的是在猪链球菌2型ΔEce1单基因缺失菌株的基础上进一步缺失Salk/R基因，获得安全性高、免疫原性好的猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株。

[0007] 本发明的第二个目的是利用构建的猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株制备成猪链球菌2型双基因缺失活疫苗。

[0008] 本发明的第三个目的是该猪链球菌2型双基因缺失活疫苗的应用。

[0009] 本发明通过以下技术方案实施：

[0010] 涉及本发明的核心生物材料的猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R菌株(Streptococcussuis IIΔEce1/ΔSalk/R)是申请人自行构建的，申请人将该双基因缺失菌株命名为猪链球菌II型(Streptococcus suis II)ΔEce1/ΔSalk/R，将该菌株于2010年12月21日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2010360。

[0011] 本发明的双基因缺失突变体的构建方法是：设计引物扩增Salk/R基因的上下游同源臂，将其连接到自杀性质粒pSET4s(Daisuke T et al.Construction and characterization ofStreptococcus suis-Escherichia coli shuttle cloning vectors.Plasmid，2001，45：101-113)上构建重组穿梭质粒，再将重组质粒电转化到猪链球菌2型ΔEce1单基因缺失菌株中，利用温度与抗性进行筛选，获得一种猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株。

[0012] 本发明的主要优点是：

[0013] 本发明是在猪链球菌2型Ece1单基因缺失菌株的基础上构建的猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株，Salk/R基因缺失后其毒力大幅度下降，安全性高，不存在毒力返强的风险，免疫原性高，能够保护免疫猪抵抗猪链球菌2型强毒菌株(地方分离株SC19)的攻击，且制作工艺简单，成本低，为有效控制我国猪链球菌病的发生与流行提供了有用的工具。

[0014] 为深入评价用该猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株制备的猪链球菌2型双基因缺失活疫苗在预防猪链球菌2型的感染中的应用，用制备的猪链球菌2型双基因缺失活疫苗在试验动物35-42日龄仔猪上进行了安全性评价和免疫效果的评价。

附图说明

[0015] 序列表SEQ ID NO：1是缺失基因Ece1的核苷酸序列(GenBank登录号：GeneID：5099191)。

[0016] 序列表SEQ ID NO：2是缺失基因Salk/R的核苷酸序列(即Salk与SalR为双组份信号转导系统两个元件，其GenBank登录号：GeneID：5099618和GeneID：5100603)。

[0017] 图1：温敏型自杀性质粒pSET4s-ΔSalk/R的构建流程图。

[0018] 图2：温敏型自杀性质粒pSET4s-ΔSalk/R的酶切鉴定结果。

[0019] 图中M1为DNA marker(DL 15000)；M2为DNA marker(DL 2000)；1，2为Hind III和EcoR I双酶切pSET4s-ΔSalk/R。

[0020] 图3：猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株的PCR鉴定结果。

[0021] 图中标记：M1：DNA marker(DL 15000)；M2：DNA marker(DL 2000)；1-4，用p5/p6引物进行扩增；5-8，用p7/p8引物进行扩增；9-12，用p1/p2引物进行扩增；13-16，用p3/p4引物进行扩增；1，5，9，13：模板为SS2强毒菌株(猪链球菌2型地方分离株SC19)；2，6，10，14：模板为猪链球菌2型ΔEce1单基因缺失菌株；3，7，11，15：模板为猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株；4，8，12，16：空白对照。

[0022] 图4：猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株在体外传代的遗传稳定性检测结果。

[0023] 图中标记：M1为DNA marker(DL 15000)；M2为DNA marker(DL 2000)；1-15为引物p1/p2扩增猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株1-15代菌。

[0024] 图5：猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株、猪链球菌2型ΔEce1单基因缺失菌株与SS2地方分离株SC19的生长曲线。

[0025] 图6：猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株、猪链球菌2型ΔEce1单基因缺失菌株与SS2地方分离株SC19对Hep2细胞的黏附比率。

[0026] 图7：猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株、猪链球菌2型ΔEce1单基因缺失菌株与SS2地方分离株SC19对Hep2细胞的毒性比率

[0027] 图8：猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株免疫猪后的抗体水平。

[0028] 图9：猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株免疫后强毒攻击猪只存活情况。

[0029] 图10：是猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株免疫后强毒攻击猪只的体温变化。

[0030] 表1：猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株免疫后SS2强毒菌株(猪链球菌2型地方分离株SC19)攻击猪只后各组织带菌量检测结果。

具体实施方式

[0031] 实施例1

[0032] 以下结合说明书附图对本发明作进一步的说明，但不限制本发明的保护范围。

[0033] 一、引物设计(用于基因克隆和分子检测)

[0034] 根据GenBank上公布的猪链球菌2型05ZYH33株全基因组GB|CP000407.1|(Chen C，et al.A glimpse of streptococcal toxic shock syndrome from comparative genomics of S.suis 2 Chineseisolates.PLoS ONE，2007，2：312-315)设计引物pSu1/pSu2和pSd1/pSd2(序列见后所述)，从猪链球菌2型野生菌(地方分离株)SC19(该菌株2005年5月分离自四川省猪链球菌病中的一头病猪，为强毒株，具有MRP+EF+SLY+表型；参见文献Li W，Liu L，Qiu D，Chen H and Zhou R.Identification of Streptococcus suis serotype 2 genes preferential expressed in the natural host.Int JMed Microb，
2010，300：482-488)基因组中分别扩增Salk/R基因的上游同源臂Salk/R-up(序列长度为
996bp)和下游同源臂Salk/R-down(序列长度为986bp)。同时设计位于Salk/R基因两侧的引物对p1/p2和位于Salk/R基因内部的引物对p3/p4，用于筛选鉴定双基因缺失突变株。

[0035] 根据谭臣(谭臣，猪链球菌2型Ece1的致病性及6PGD蛋白的免疫原性研究，中国知网，2010，博士论文；http://epub.cnki.net/grid2008/detail.aspx？QueryID＝3&CurRec＝1)报道的Ece1基因的鉴定引物序列合成引物对p5/p6和p7/p8用于PCR扩增鉴定猪链球菌2型Ece1基因是否缺失，反应条件为：94℃预变性10min；94℃1min，
55℃1min，72℃2.5min，30个循环后，72℃延伸10min。PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，若是猪链球菌2型ΔEce1缺失突变株，则引物对p5/p6扩增应得到一条479bp的DNA片断，若是SS2地方分离株SC19，则得到一条2309bp的DNA片断。另一对引物p7/p8扩增的目的片段位于Ece1基因的内部，猪链球菌2型ΔEce1突变株扩增应为阴性，野生菌株可以扩增到776bp的片段。上述引物均由南京金斯瑞有限公司合成。引物的核苷酸序列如下：

[0036] pSu1：5′--CGCAAGCTTGTAGGAACAATCTATACAGAGGC--3′HindIII酶切位点[0037] pSu2：5′--CGCGGATCCTTACCCTTTTTACTCATGATTTT--3′BamHI酶切位点[0038] pSd1：5′--CGCGGATCCGCTGAGCGATATAGATATTAACG--3′BamHI酶切位点[0039] pSd2：5′--CGCGAATTCATAAGAGAACCTATTTAGCTCCC--3′EcoRI酶切位点[0040] p1：5′--TGTGCCAAAAACGCTCTATC--3′

[0041] p2：5′--CAAACTCCGCTCCCCTAAG--3′

[0042] p3：5′--ACAAAGATAAGCCTTTTAGCAAT--3′

[0043] p4：5′--TAGACAATCCAAGCGTATCAGTT--3′

[0044] p5：5′--GAATTACTTTGTTTGGGAATG--3′

[0045] p6：5′--GTTATGACTGGTTAAATAC--3′

[0046] p7：5′--ACGTTACTCAAGATATAAAAGACAG--3′

[0047] p8：5′--GATTTTAACAACCAATGTATCTAGT--3′

[0048] 二、pSET4s-SalK/R重组转移质粒的构建(见图1所示)

[0049] 用引物对pSu1/pSu2和pSd1/pSd2从SS2地方分离株SC19基因组中扩增Salk/R基因上下游同源臂Salk/R-up(996bp)和Salk/R-down(986bp)，反应程序为：94℃预变性10min；94℃1min，55℃1min，72℃1min30sec，35个循环，最后72℃延伸10min。用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。纯化回收目的片段，纯化的Salk/R基因上游同源臂扩增产物用HindIII和BamHI双酶切后直接连接到质粒pSET4s(日本国立动物卫生研究所的Daisuke Takamatsu博士惠赠)的HindIII和BamHI位点，获得的重组质粒pSET4s-SU，经HindIII和BamHI酶切证实构建正确。随后将纯化的Salk/R基因下游同源臂扩增产物用BamHI和EcoRI双酶切后连接到所构建的质粒pSET4s-SU的BamHI和EcoRI位点，经HindIII和EcoRI双酶切证实构建正确，测序证实无碱基误配，将获得的质粒命名为pSET4s-Salk/R(见图2)。质粒的重组、制备、酶切分析均按常规方法进行(J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002年)。

[0050] 三、猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株的筛选与鉴定

[0051] 参照Daisuke Takamatsu博士报道的方法(Daisuke T et al，Construction and characterizationof Streptococcus suis-Escherichia coli shuttle cloning vectors.Plasmid，2001，45：101-113)，将获得的自杀性重组转移质粒pSET4s-Salk/R在电转化参数2.5KV/cm，500Ω和25μF的条件下电转化至猪链球菌2型ΔEce1单基因缺失菌株制成的电转化感受态细胞中，电转化后涂100μg/ml壮观霉素抗性平皿置28℃下培养，长出单菌落后再置37℃下培养。在此过程中，重组转移质粒pSET4s-Salk/R与猪链球菌2型ΔEce1单基因缺失菌株基因组发生一次同源重组获得单交换，单交换鉴定正确后我们把单交换进行传代来筛选突变株，其会发生第二次同源重组从而获得双基因缺失突变体。第二次同源重组有可能产生两种不同的菌株：一种是产生所需要的猪链球菌2型ΔEce1ΔSalk/R双基因缺失突变株；另一种是产生回复的亲本菌株。

[0052] 申请人通过PCR方法海量筛选猪链球菌2型ΔEce1ΔSalk/R双基因缺失菌株。挑取各代单交换培养出来的单克隆同时接种无抗性与壮观霉素抗性的TSA平皿进行培养，然后挑取在壮观霉素抗性条件下无法生长而在无抗性平皿上生长良好的的单菌落于3ml含10％新生牛血清的TSB液体培养基(购自美国BD公司)中37℃振荡培养后用作模板，利用引物对p1/p2和p3/p4进行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性10min；94℃1min，
55℃1min，72℃2min30sec，30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，若是猪链球菌2型ΔEce1ΔSalk/R双基因缺失菌株，则引物对p1/p2扩增应得到一条500bp的DNA片断，若是回复成亲本菌株，则得到一条2268bp的DNA片断。另一对引物p3/p4扩增的目的片段位于缺失基因的内部，对猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株扩增应为阴性，猪链球菌2型地方分离株SC19和猪链球菌2型ΔEce1单基因缺失菌株则可获得117bp的片段。通过PCR扩增筛选到突变株后再用引物对p1/p2进行扩增，并将扩增的片段进行测序分析，结果证实猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失突变株构建成功。

[0053] 四、猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株生物学特性分析

[0054] 4.1遗传稳定性分析

[0055] 将猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株于含有10％新生牛血清的TSA(TrypticSoy Agar购至美国BD公司)平皿上连续传代，一共传15代，每一代挑取单菌落于3ml含10％的新生牛血清的TSB液体培养基中37℃振荡培养，用引物p1/p2对每一代细菌进行PCR扩增，结果均只能获得500bp的片段(图4)，说明猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株在体外培养基中连传15代是稳定的。

[0056] 4.2生长特性

[0057] 将猪链球菌2型地方分离菌株SC19、猪链球菌2型ΔEce1单基因缺失菌株和本发明的猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株分别接种于5ml含有10％新生牛血清(购自杭州四季青材料有限公司)的TSB培养基(Tryptic Soy Broth购自美国BD公司)中培养，并于培养后每间隔一小时分别取100μL菌液测定OD600值，绘制生长曲线(附图5)。结果显示猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株、猪链球菌2型ΔEce1单基因缺失菌株和猪链球菌2型地方分离株SC19的生长曲线无显著差异，表明Ece1和Salk/R两个基因的缺失并不影响猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株的生长。

[0058] 4.3细胞黏附实验

[0059] 细菌黏附细胞是细菌感染细胞引起致病的第一步也是关键性的一步，细菌黏附细胞的能力与其毒力直接相关。细胞侵入实验主要参考Charland和Gottschalk(2000)所报道的方法来进行(Charland N，et al.Streptococcus suis serotype 2 interactions with human brainmicrovascular endothelial cells.Infect Immunity，2000，68：637-643；Segura M et al.Streptococcussuis interactions with the murine macrophage cell line J774：adhesion and cytotoxicity.InfectImmunity，2002，70：
4312-4322)，具体操作是：取1ml生长到指数生长期的猪链球菌2型地方分离株SC19、猪链球菌2型ΔEce1单基因缺失菌株和猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株经6000rpm离心5min收集细菌、用磷酸盐缓冲溶液PBS(配方：NaCl 137mmol/L，KCl
2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L)洗涤后，重悬于不含抗生素的细胞培养TM
基DMEM(购自Gibco 公司)中，稀释后按10m.o.i.的感染复数接种到Hep2细胞(购自中国典型培养物保藏中心)已长成单层的24孔细胞培养板中。然后将细胞板于800g离心
10min，以加强细菌与单层细胞表面的接触。之后，将细胞板于37℃，5％CO2培养箱中培养
2h，使细菌侵入细胞。用磷酸盐缓冲溶液PBS洗细胞单层3次，然后在每个孔加入1ml含有-1
100μg ml-1庆大霉素和5μg ml 青霉素G的DMEM细胞培养基中，于37℃含5％CO2的培养箱中培养2h以将细胞外的和黏附于细胞表面的细菌杀死。然后用磷酸盐缓冲溶液PBS洗细胞单层3次，随后加入500ul的去离子水以破坏细胞膜，并用移液器反复吹打。每孔各取
100ul细菌悬液涂布TSA平板，在37℃，5％CO2培养箱中温育过夜，观察菌落的形成情况，并计算出细菌c.f.u.。侵入效率以细菌的c.f.u.来表示。实验结果表明，本发明的猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株和猪链球菌2型ΔEce1单基因缺失菌株与猪链球菌2型地方分离株SC19相比黏附Hep2细胞的能力显著减弱，但猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株与猪链球菌2型ΔEce1单基因缺失菌株对Hep2细胞的黏附能力无显著差异(图6)。

[0060] 4.4细胞毒性实验

[0061] 细菌对细胞的毒性往往是破坏宿主正常细胞结构的重要的一环，本实验参考Charland和Gottschalk(2000)报道的方法(Charland N，et al.Streptococcus suis serotype 2 interactions withhuman brain microvascular endothelial cells.Infect Immunity，2000，68：637-643)，通过检测胞内乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)向外释放的量来评价细菌对细胞的毒性。具体操作按试剂盒说明书(细胞毒性检测试剂盒为Promega公司产品)进行：分别离心收集对数生长期的猪链球菌2型地方分离菌株SC19、猪链球菌2型ΔEce1单基因缺失菌株和猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株8
(约3×10 个细菌)，磷酸缓冲液PBS洗涤后，分别悬浮于1ml不含血清和抗生素的DMEM中，并用无血清和抗生素的DMEM进行适当的稀释，将细菌悬液加入Hep2细胞已长至单层的96孔细胞板中，使细菌的感染复数为每细胞10m.o.i.，各作4个重复。同时设置效应细胞自发乳酸脱氢酶(LDH)释放对照、靶细胞自发LDH释放对照、靶细胞最大LDH释放对照、体积校正对照、培养基背景对照。细胞培养板在37℃，5％CO2培养箱中培养4h，收集上清前45min向靶细胞最大LDH释放对照孔加入5μL细胞裂解液(Lysis solution)。280g离心5min，用排枪转移50μL上清到一块新的96孔细胞培养板中，每孔加入50μL配制好的底物，避光室温孵育30min，再加入50μL终止液(stopsolution)，在OD值490nm下测量吸光值，按计算公式：％细胞毒性＝[(实验-效应细胞自发-靶细胞自发)/(靶细胞最大-靶细胞自发)]×100计算不同菌株对Hep2细胞的毒性。结果显示猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株和猪链球菌2型ΔEce1单基因缺失菌株对Hep2细胞的毒性均显著低于猪链球菌2型地方分离株SC19，但两个突变体对Hep2细胞的毒性无显著差异(图7)。

[0062] 五、猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失疫苗的制备

[0063] 将鉴定正确、生长特性正常、遗传稳定，并具有良好生物学活性的猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株以与TSB培养基按照体积比为1∶100的量接种到加有10％新生牛血清(购自杭州四季青材料有限公司)的TSB培养基中培养过夜，5000rpm离心
5min收集菌体，用生理盐水悬浮菌体后再5000rpm离心5min收集菌体，生理盐水悬浮后，按菌液∶明胶保护剂为7∶1的体积比加入明胶保护剂，充分混匀后按2.0mL/瓶分装于灭菌青霉素瓶中，置冷冻干燥机中冻干，压盖后置4℃保存备用。

[0064] 六、动物实验

[0065] 6.1安全性试验

[0066] 用生理盐水重悬冻干的猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株，经颈部9 8 7
肌肉接种35日龄链球菌阴性健康仔猪，分10、10、10c.f.u.3个剂量组，每组5头，同时设
6 7
10c.f.u.剂量的猪链球菌2型SC19地方分离株感染仔猪对照组和10c.f.u.剂量的猪链球菌2型ΔEce1单基因缺失菌株感染仔猪对照组，并于感染后每天观察实验猪的临床表现，共观察21天。结果在整个观察期内猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株接
6 7
种猪没有出现任何不良反应，而10c.f.u.野生菌和10c.f.u.剂量的猪链球菌2型ΔEce1单基因缺失菌株感染仔猪后第二天即表现出很明显的猪链球菌病临床症状：高稽留热、食欲不振、嗜睡、乏力、共济失调、关节肿胀、跛行、角弓反张、全身红肿、卧地不起等，野生菌感染对照组猪只于感染后5天内全部死亡，猪链球菌2型ΔEce1单基因缺失菌株感染对照组猪只4头于感染后5天内死亡。实验结果说明猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失
9 8 7
菌株比猪链球菌2型ΔEce1单基因缺失菌株毒力要下降很多，10，10，10c.f.u.3个剂量的猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株对仔猪均是安全的。

[0067] 6.2仔猪的免疫与抗体检测

[0068] 将16头35日龄猪链球菌为阴性的健康仔猪分为3组，其中免疫攻毒组和非免疫攻毒组各7头，空白对照组2头。用生理盐水重悬冻干的猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌，经颈部肌肉接种免疫攻毒组仔猪，每头接种1ml，菌量为108c.f.u.；非免疫攻毒组和空白对照组经颈部肌肉接种1ml生理盐水，共免疫1次。所有实验猪于免疫后2周和3周分别通过颈静脉丛采血，分离血清后用武汉科前动物生物制品有限责任公司生产的猪链球菌CPSELISA抗体检测试剂盒检测针对猪链球菌2型的抗体水平，结果如图8所示，免疫组猪只均产生了较高水平的特异性抗体，而非免疫对照组和空白对照组均为阴性。

[0069] 6.3保护力试验

[0070] 免疫后第28天，免疫攻毒组与非免疫攻毒组仔猪经耳缘静脉注射106c.f.u.的猪链球菌2型地方分离株SC19，空白对照不作处理。于攻毒后第三天剖杀免疫攻毒组与非免疫攻毒组各2头猪及空白对照组仔猪，以观察其组织器官的病变情况，同时取样检测组织带菌量。免疫攻毒组与非免疫攻毒组另外的5头猪用于发病情况与死亡情况的观察。结果免疫攻毒组猪只在攻毒后两天内体温略有升高，以后恢复到正常水平，未表现出其它不良反应，而非免疫攻毒组的所有猪只在攻毒后表现出高稽留热、食欲不振、嗜睡、乏力、共济失调、关节肿胀、跛行、角弓反张、全身红肿、卧地不起等严重的猪链球菌病症状，并于一周内全部发病死亡(图9、10)，实验结果说明本发明的猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株能够保护免疫猪抵抗猪链球菌2型强毒菌株SC19的攻击。

[0071] 剖杀猪只发现免疫攻毒组的猪只各组织器官与空白对照组的猪只基本一样，未发现有明显的病理变化。而非免疫攻毒组的猪只解剖后发现其各个组织器官都有一定程度的病变，主要表现在：消化道黏膜、上呼吸道粘膜充血、出血，肺肿胀，充血出血；脑膜充血、出血，脑膜下积液，脑组织切面有点状出血；心内膜出血，心包内有大量淡黄色积液；肝脏、肾脏以及脾脏肿大、出血，脾暗红或蓝紫；关节腔内有黄色胶冻样或纤维素性、脓性渗出物。

[0072] 称取采集的脑、肺脏、肝脏、心脏、脾脏、肾脏、淋巴结等组织各0.2g，加1ml磷酸缓冲液PBS匀浆。各取100μL匀浆液并做适当的稀释后涂布于含有10％新生牛血清的TSA平皿，同时取实验猪的抗凝血各100μL同样涂布含有10％新生牛血清的TSA平皿，于37℃温箱中培养24h后计算0.1g组织的带菌量(c.f.u./0.1g组织)，结果如表1所示，免疫攻毒组猪只除了心脏、肾脏、淋巴结和血液中能检测到极少量细菌外，其余组织均不带菌，而非免疫攻毒对照组猪只各组织中均能检测到大量的细菌。同时对分离获得的菌用p1/p2引物进行PCR扩增(反应条件为：94℃预变性10min；94℃1min，55℃1min，72℃1.5min，30个循环后，72℃延伸10min)证实所分离的菌均为猪链球菌2型野生菌SC19。实验结果进一步说明猪链球菌2型ΔEce1/ΔSalk/R双基因缺失菌株能够保护免疫猪抵抗猪链球菌2型强毒菌株SC19的攻击。

[0073] 表.1猪链球菌强毒菌株SC19在各组织中的分布情况(单位：c.f.u./0.1g组织)[0074]

[0075] 说明书说明：为了表述方便，本发明中出现的猪链球菌2型菌株与猪链球菌II型菌株为同一个菌株。

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细菌毒力因子及其用途-专利编号CN101711861A	2020-05-13	484
细菌毒力基因-专利编号CN1735689A	2020-05-11	1122
捕食螨毒力测定方法-专利编号CN104165972A	2020-05-12	663
捕食螨毒力测定方法-专利编号CN104165972B	2020-05-11	950
降低细菌的毒力的方法-专利编号CN102883602A	2020-05-11	945
细菌毒力因子及其用途-专利编号CN1922324B	2020-05-13	737
降低细菌的毒力的方法-专利编号CN102883602B	2020-05-12	964
细菌毒力因子及其用途-专利编号CN1922324A	2020-05-12	223
叶螨毒力测定实验装置-专利编号CN108469497A	2020-05-11	272
捕食螨毒力测定装置-专利编号CN204154697U	2020-05-13	1039

一种猪链球菌2型双基因缺失活疫苗及应用

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