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一种基因组携带外源基因的减毒重组单增李斯特菌及制备方法

阅读：475发布：2021-03-02

IPRDB可以提供一种基因组携带外源基因的减毒重组单增李斯特菌及制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种基因组携带外源基因的减毒重组单增李斯特菌及制备方法，将外源基因(不仅限于抗原基因)整合入单增李斯特菌，不引入任何抗生素耐药基因，同时完整敲除细菌actA、plcB毒力基因，所制备的减毒重组单增李斯特菌可诱导高水平的细胞免疫应答，可对单增李斯特菌载体疫苗的制备提供可靠的技术方法。，下面是一种基因组携带外源基因的减毒重组单增李斯特菌及制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种基因组携带外源基因的减毒重组单增李斯特菌，其特征在于，所述减毒单增李斯特菌为单增李斯特菌完整敲除actA和plcB这两个毒力基因而得。

2.根据权利要求1所述的一种基因组携带外源基因的减毒重组单增李斯特菌，其特征在于，所述外源基因的上游带HindⅢ酶切位点、下游带XhoⅠ酶切位点。

3.权利要求1或2所述一种基因组携带外源基因的减毒重组单增李斯特菌的制备方法，其特征在于，是以减毒单增李斯特菌为载体，携带外源基因而得。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)将拟整合的外源基因插入质粒pCW203的Hind III酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到中间重组质粒；

(2)切下步骤(1)得到的中间重组质粒的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间的片段插入重组质粒pCW180的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到打靶质粒，所述重组质粒pCW180的基因序列为序列表中SEQ ID NO.1所示；

(3)将步骤(2)得到的打靶质粒电转化重组单增李斯特菌LmΔactAplcB-lacZ，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，得到目标菌。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述外源基因的制备方法是：从生物基因组模板或基因克隆质粒库PCR扩增得到，或DNA合成仪直接合成。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，重组质粒pCW180的制备方法如下：(2-1)将上游携带SpeⅠ、下游携带NotⅠ的Lm mpl基因插入质粒pCW154的SpeⅠ和NotⅠ酶切位点之间，得到第一中间重组质粒pCW160，所述第一中间重组质粒pCW160的基因序列为序列表中SEQ ID NO.2所示；

(2-2)将上游携带XbaⅠ、下游携带NotⅠ的Lm orfBAldh基因插入上述步骤(2-1)得到的第一中间重组质粒pCW160的XbaⅠ和NotⅠ酶切位点之间，得到第二中间重组质粒pCW170，所述第二中间重组质粒pCW170的基因序列为序列表中SEQ ID NO.3所示；

(2-3)用NotⅠ酶切质粒pCW154，得到两头为NotⅠ酶切位点的一段基因，插入上述步骤(2-2)得到的第二中间重组质粒pCW170的NotⅠ酶切位点，得到重组质粒pCW180。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，重组单增李斯特菌LmΔactAplcB-lacZ的制备方法如下：(3-1)将上、下游分别带Not I酶切位点的lacZ基因片段插入第二中间重组质粒pCW170的Not I酶切位点之间，得到一个打靶质粒pCW190，所述质粒pCW190的基因序列为序列表中SEQ ID NO.4所示；

(3-2)将步骤(3-1)所得打靶质粒pCW190电转化单增李斯特菌，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，即得。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，重组单增李斯特菌LmΔactAplcB-lacZ的基因组orfBAldh基因上游整合入了β-半乳糖苷酶基因，能表达β-半乳糖苷酶，在含5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的培养基上长成蓝色菌落。

9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述目标菌的基因组内orfBAldh基因上游整合了外源基因。

说明书全文

一种基因组携带外源基因的减毒重组单增李斯特菌及制备

方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种基因组携带外源基因的减毒重组单增李斯特菌及制备方法。

背景技术

[0002] 单增李斯特菌(Listeria monocytogenes，在下文中简称Lm)由于具有独特的能在感染的宿主吞噬细胞浆内生长的生物学特性，成为了良好的T细胞免疫活化佐剂，已在疫苗制备上得到了广泛应用，部分以Lm为载体的重组活菌治疗性肿瘤疫苗已进入临床试验阶段。如Wood LM et al.报道构建的两种基因重组Lm活菌疫苗(Lm-LLO-CD105A和Lm-LLO-CD105B)能显著减小乳腺癌小鼠动物模型的原发性和转移性肿瘤组织体积、降低乳腺癌自发小鼠模型肿瘤发生率(Wood LM,Pan ZK,Guirnalda P,et al.Targeting tumor vasculature with novel Lmsteria-based vaccines directed against CD105.Cancer Immunol Immunother.2011,60(7): 931-942)。此外，还有一些以单增李斯特菌为背景的疫苗已经进入临床试验如PSA，Her2等 (Wood,Laurence M.,and Yvonne Paterson.2014.“Attenuated Listeria Monocytogenes:A Powerful and Versatile Vector for the Future of Tumor Immunotherapy.”Frontiers in Cellular and Infection
Microbiology 4:51–51.)。

[0003] 但是上述重组Lm菌携带的外源基因是以质粒的方式引入，没有整合进细菌基因组，所以目标基因的表达不稳定，有可能随着质粒丢失而失去，并且质粒的引入还带入了其他非肿瘤抗原相关基因，尤其是上述质粒引入了氯霉素抗性基因，给细菌耐药的传播造成了威胁。由于Lm可对人致病，故作为疫苗载体的Lm需经严格地敲除致病相关基因进行减毒，而现有的作为疫苗载体的Lm菌株的减毒方式不明确，有的仅部分敲除毒力基因，存在毒力返祖可能。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基因组携带外源基因的减毒重组单增李斯特菌及制备方法。

[0005] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0006] 一种基因组携带外源基因的减毒重组单增李斯特菌，所述减毒单增李斯特菌为单增李斯特菌(Listeria monocytogenes，简称Lm)完整敲除actA和plcB这两个毒力基因而得。

[0007] 优选的，所述外源基因的上游带HindⅢ酶切位点、下游带XhoⅠ酶切位点。

[0008] 上述一种基因组携带外源基因的减毒重组单增李斯特菌的制备方法，是以减毒单增李斯特菌为载体，携带外源基因而得。

[0009] 优选的，具体步骤如下：

[0010] (1)将拟整合的外源基因插入质粒pCW203(专利CN103074361B)的Hind III酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到中间重组质粒；

[0011] (2)切下步骤(1)得到的中间重组质粒的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间的片段插入重组质粒pCW180的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到打靶质粒，所述重组质粒pCW180的基因序列为序列表中SEQ ID NO.1所示；

[0012] (3)将步骤(2)得到的打靶质粒电转化重组单增李斯特菌LmΔactAplcB-lacZ，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，得到目标菌。

[0013] 进一步优选的，步骤(1)中，所述外源基因的制备方法是：从生物基因组模板或基因克隆质粒库PCR扩增得到，或DNA合成仪直接合成。

[0014] 进一步优选的，步骤(2)中，重组质粒pCW180的制备方法如下：

[0015] (2-1)将上游携带SpeⅠ、下游携带NotⅠ的Lm mpl基因(Genbank ID：DQ054595.1) 插入质粒pCW154(专利CN103074361B)的SpeⅠ和NotⅠ酶切位点之间，得到第一中间重组质粒pCW160，所述第一中间重组质粒pCW160的基因序列为序列表中SEQ ID NO.2所示；

[0016] (2-2)将上游携带XbaⅠ、下游携带NotⅠ的Lm orfBAldh基因(Genbank ID：M82881.1) 插入上述步骤(2-1)得到的第一中间重组质粒pCW160的XbaⅠ和NotⅠ酶切位点之间，得到第二中间重组质粒pCW170，所述第二中间重组质粒pCW170的基因序列为序列表中SEQ ID NO.3所示；

[0017] (2-3)用NotⅠ酶切质粒pCW154，得到两头为NotⅠ酶切位点的一段基因，插入上述步骤(2-2)得到的第二中间重组质粒pCW170的NotⅠ酶切位点，得到重组质粒pCW180。

[0018] 进一步优选的，步骤(3)中，重组单增李斯特菌LmΔactAplcB-lacZ的制备方法如下：

[0019] (3-1)将上、下游分别带Not I酶切位点的lacZ基因片段(专利CN103074361B)插入第二中间重组质粒pCW170的Not I酶切位点之间，得到一个打靶质粒pCW190，所述质粒 pCW190的基因序列为序列表中SEQ ID NO.4所示；

[0020] (3-2)将步骤(3-1)所得打靶质粒pCW190电转化Lm，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，即得。

[0021] 进一步优选的，步骤(3)中，重组单增李斯特菌LmΔactAplcB-lacZ的基因组orfBAldh 基因上游整合入了β-半乳糖苷酶基因，能表达β-半乳糖苷酶，在含5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的培养基上长成蓝色菌落。

[0022] 进一步优选的，步骤(3)中，所述目标菌的基因组内orfBAldh基因上游整合了外源基因。

[0023] 本发明的有益效果在于：

[0024] 本发明将外源基因(不仅限于抗原基因)整合入Lm，不引入任何抗生素耐药基因，同时完整敲除细菌actA、plcB毒力基因，所制备的减毒重组单增李斯特菌可诱导高水平的细胞免疫应答，可对单增李斯特菌载体疫苗的制备提供可靠的技术方法。具体如下：

[0025] 1、携带外源基因的重组单增李斯特菌能诱导体内高效的抗原特异性CD4+和CD8+细胞免疫应答，分泌高水平的IFN-γ细胞因子，相比携带外源基因的重组绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii，简称Li)来说，诱导的抗原特异性细胞因子的分泌量显著提高。

[0026] 2、敲除了细菌的致病基因actA和plcB，保证了重组菌的安全性。动物实验表明，减毒后的细菌的LD50比野生株显著提高，接种动物后对动物重要器官肝、脾的病理损伤显著降低，被机体清除的速度也大大加快。

[0027] 3、重组菌不含耐药基因，保证了其在制备疫苗等领域应用的环境安全性。

[0028] 4、制备操作简单，筛选容易。制备方法仅需简单的几步常规分子克隆、细菌培养等相关操作，对仪器设备和操作技术的要求不高，成本低廉，制备成功后，重组菌可大量繁殖，易于大规模生产。采用菌落颜色和抗生素耐药情况筛选目标菌，目标菌为不耐红霉素的白色菌落，筛选方法简单容易，肉眼即可判断。

[0029] 5、重组结果稳定。外源基因定点整合至Lm基因组orfBAldh基因上游，整合后的细菌生长不受影响，整合后的外源基因稳定存在于细菌基因组，不会丢失，克服了重组质粒可能具有的丢失风险。

[0030] 6、标签齐备，便于检测。外源基因整合后携带CD8+和CD4+T细胞识别表位便于检测针对外源拟整合基因的特异性CD8+和CD4+T细胞应答；携带HA western blot检测标签，便于western blot检测外源整合基因编码的融合蛋白。

附图说明

[0031] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

[0032] 图1为第一中间重组质粒pCW160的一种结构图谱，含有氨苄青霉素抗性基因(Amp)、红霉素抗性基因(Ery)，Lm mpl基因位于SpeⅠ和NotⅠ酶切位点之间，Li orfBAldh基因位于XbaⅠ和NotⅠ酶切位点之间。

[0033] 图2为第二中间重组质粒pCW170的一种结构图谱，含有氨苄青霉素抗性基因(Amp)、红霉素抗性基因(Ery)，Lm mpl基因位于SpeⅠ和NotⅠ酶切位点之间，Lm orfBAldh基因位于XbaⅠ和NotⅠ酶切位点之间。

[0034] 图3为重组质粒pCW180的一种结构图谱，含有氨苄青霉素抗性基因(Amp)、红霉素抗性基因(Ery)，Lm mpl基因位于SpeⅠ和NotⅠ酶切位点之间，Lm orfBAldh基因位于Xba Ⅰ和NotⅠ酶切位点之间，基因序列盒(gene cassette)位于两个NotⅠ位点之间：包含启动子 phly、分泌信号肽(secret signal)、HA epitope基因、VSV-G epitope基因、GP33epitope基因、 GP61epitope基因、PRRSV ORF5基因、供外源基因插入的BamHⅠ、XhoⅠ位点。

[0035] 图4为打靶质粒pCW190的一种结构图谱，含有氨苄青霉素抗性基因(Amp)、红霉素抗性基因(Ery)，Lm mpl基因位于SpeⅠ和NotⅠ酶切位点之间，Lm orfBAldh基因位于Xba Ⅰ和NotⅠ酶切位点之间，lacZ基因位于两个NotⅠ位点之间。

[0036] 图5为LmΔactAplcB-lacZ的PCR鉴定电泳结果图，图中，1为以LmΔactAplcB-lacZ基因组为模板扩增actA，2为以LmΔactAplcB-lacZ基因组为模板扩增orfBAldh，3～4为以 LmΔactAplcB-lacZ基因组为模板扩增Ery，5为Ery基因扩增阳性对照，6为以Lm基因组为模板扩增lacZ，7～8为以LmΔactAplcB-lacZ基因组为模板扩增lacZ，M为DNA ladder。

[0037] 图6为蓝白斑筛选同源重组成功的阳性重组菌。同源重组后，细菌从蓝色变为白色，通过颜色的辨识可以很方便地初步筛选出阳性菌(图中箭头所指为其中之一)。

[0038] 图7为抗生素筛选同源重组成功的阳性重组菌。同源重组后，细菌从耐红霉素变为不耐红霉素，同一个菌落同时划线有红霉素的平板和无红霉素的平板，仅能在无红霉素的平板上生长(图中箭头所指为其中之一)。

[0039] 图8为制备基因组携带间皮素基因的重组减毒单增李斯特菌的同源重组过程示意图。

[0040] 图9为C57BL/6小鼠尾静脉接种Lm、Lm△actAplcB-MESO后的生存曲线。A是小鼠尾静脉接种如图所示3个剂量的Lm后的生存曲线，B是小鼠尾静脉接种如图所示3个剂量的 Lm△actAplcB-MESO后的生存曲线。

[0041] 图10为Lm(接种剂量：4×104CFU)和Lm△actAplcB-MESO(接种剂量 Lm△6
actAplcB-MESO：7.8×10)通过尾静脉接种小鼠后第3天引起的小鼠肝脏和脾脏的病理变化。A：正常肝组织(100×)；C：Lm接种3天后小鼠的肝组织(100×)，可见炎症灶形状不规则，呈弥漫状，炎性细胞浸润明显；E：Lm△actAplcB-MESO接种3天后小鼠的肝组织(200×)，可见肝脏细胞广泛气球样变，胞质呈空泡状；B：正常脾组织(200×)；D：Lm 接种3天后小鼠的脾组织(40×)，可见严重的、广泛的组织坏死，造成脾小体形状不规则、边缘模糊(图中箭头所示)，破坏了脾脏正常的基本组织结构；F：Lm△actAplcB-MESO接种 3天后小鼠的脾组织(200×)，可见脾脏脾小结淋巴细胞松散，红髓中可见少量中性粒细胞浸润。由图可知，减毒菌株在接种菌量更大的情况下在相同时间内引起的病理损伤更轻，表现了更低的毒性。

[0042] 图11为通过流式细胞术检测LmΔactAplcB-MESO及LiΔactAplcB-MESO菌株免疫小鼠后所诱导的细胞免疫应答。LiΔactAplcB-MESO为携带间皮素基因的重组绵羊李斯特菌， LmΔactAplcB-MESO及LiΔactAplcB-MESO疫苗菌株以0.1×LD50的剂量尾静脉接种小鼠，采用流式细胞术检测免疫小鼠诱导产生的特异性细胞免疫应答，主要检测IFN-γ细胞因子的分泌水平，对疫苗候选株免疫效果进行评价。A为免疫了LiΔactAplcB-MESO的小鼠脾细胞在GP33肽段刺激下，IFN-γ细胞因子的分泌水平；B为免疫了LmΔactAplcB-MESO的小鼠脾细胞在GP33肽段刺激下，IFN-γ细胞因子的分泌水平。如图所示，携带同样抗原基因的重组单增李斯特菌诱导的抗原特异性IFN-γ的量与重组绵羊李斯特菌相比提高了30多倍。

具体实施方式

[0043] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

[0044] 本发明下述实施例中：质粒pCW203来自于专利CN103074361B，质粒pCW154来自于专利CN103074361B，大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)Top10购自北京康为世纪生物科技有限公司；各种分子生物学试剂盒和生化试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司；各种分子生物学工具酶购自New England Biolabs；培养基购自北京陆桥技术有限责任公司；引物合成和基因测序由Invitrogen上海公司完成。

[0045] 实施例1：重组质粒(pCW180)的制备

[0046] (1)上游携带SpeⅠ、下游携带NotⅠ的Lm mpl基因的获得

[0047] 从NCBI上获取Lm mpl基因序列，在基因上游加入SpeⅠ酶切位点，下游加入NotⅠ酶切位点，将设计好的上游携带SpeⅠ、下游携带NotⅠ的Lm mpl基因序列交Invitrogen上海公司，以DNA合成仪合成目标DNA片段。

[0048] (2)Lm mpl基因片段插入质粒pCW154的SpeⅠ和NotⅠ酶切位点之间，获得第一中间重组质粒pCW160

[0049] Lm mpl基因片段和pCW154分别以SpeⅠ和NotⅠ双酶切，双酶切体系为10×buffer 3μl，基因样品15μl，SpeⅠ0.6μl，NotⅠ0.6μl，ddH2O 10.8μl，37℃水浴反应1h。Lm mpl基因片段双酶切产物用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。质粒pCW154经双酶切，并用碱性磷酸酶作去磷酸化处理后，作0.8％琼脂糖凝胶电泳，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收长为 7325bp的片段。回收后的基因片段和质粒片段用T4连接酶连接，得到第一中间重组质粒 pCW160(图1)。连接反应体系和反应条件为：10×T4Lmgase reaction buffer 1μl，基因片段酶切回收物1μl，质粒酶切回收物4μl，T4连接酶1μl，ddH2O 3μl，室温反应2h。

[0050] 连接反应液转化感受态E.coli Top10：用预冷枪头吸5μl连接反应液于预冷50μl感受态 E.coli Top10中，用手指轻弹管底使液体混合均匀，置冰浴30min，42℃水浴30s，冰浴3min。加入250μl 37℃预热的SOC培养基，于37℃200r/min培养1h，取150μl菌液于含100μg/ml 氨苄青霉素的LB平板(以下简称LB-Amp)中央，用无菌L形玻棒将菌液涂布整个平板，于37℃培养18～24h，阳性菌(E.coli/pCW160)在该平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用SpeⅠ和NotⅠ双酶切进行鉴定。

[0051] (3)上游携带XbaⅠ、下游携带NotⅠ的Lm orfBAldh基因的获得

[0052] 从NCBI上获取Lm orfBAldh基因序列，在基因上游加入XbaⅠ酶切位点，下游加入Not Ⅰ酶切位点，将设计好的上游携带XbaⅠ、下游携带NotⅠ的Lm orfBAldh基因序列交Invitrogen 上海公司，以DNA合成仪合成目标DNA片段。

[0053] (4)Lm orfBAldh基因片段插入质粒pCW160的XbaⅠ和NotⅠ酶切位点之间，获得第二中间重组质粒pCW170

[0054] Lm orfBAldh基因片段和pCW160分别以XbaⅠ和NotⅠ双酶切，双酶切体系为10×buffer 3μl，基因样品15μl，XbaⅠ0.6μl，NotⅠ0.6μl，ddH2O 10.8μl，37℃水浴反应1h。Lm orfBAldh 基因片段双酶切产物用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。质粒pCW160经双酶切，并用碱性磷酸酶作去磷酸化处理后，作0.8％琼脂糖凝胶电泳，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收长为6941bp的片段。回收后的基因片段和质粒片段用T4连接酶连接，得到第二中间重组质粒pCW170(图2)。连接反应体系和反应条件同步骤(2)。

[0055] 连接反应液转化感受态E.coli Top10及阳性菌的筛选同步骤(2)。提取阳性菌中含有的重组质粒，用XbaⅠ和NotⅠ双酶切进行鉴定。

[0056] (5)pCW154的一段NotⅠ酶切基因片段插入质粒pCW170的NotⅠ酶切位点，得到重组质粒pCW180

[0057] pCW154和pCW170分别以NotⅠ酶切，酶切体系为10×buffer 3μl，基因样品15μl，Not Ⅰ0.6μl，ddH2O 11.4μl，37℃水浴反应1h。pCW154基因片段酶切产物作0.8％琼脂糖凝胶电泳，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收长为1163bp的片段；质粒pCW170经酶切，并用碱性磷酸酶作去磷酸化处理后，用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。回收后的基因片段和质粒片段用T4连接酶连接，得到重组质粒pCW180(图3)。连接反应体系和反应条件同步骤(2)。

[0058] 连接反应液转化感受态E.coli Top10及阳性菌的筛选同步骤(2)。提取阳性菌中含有的重组质粒，用NotⅠ酶切进行鉴定。

[0059] 实施例2：重组菌LmΔactAplcB-lacZ的制备

[0060] (1)lacZ基因片段的获得

[0061] 如专利201310044170.5所述获得两头带Not I酶切位点的lacZ基因片段。

[0062] (2)构建制备LmΔactAplcB-lacZ用的打靶质粒pCW190

[0063] 分别对步骤(1)得到的lacZ和实施例1步骤(4)得到pCW170用Not I酶切。Not I酶切体系和反应条件同实施例1中步骤(5)。lacZ基因片段酶切产物用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。质粒pCW190经酶切，并用碱性磷酸酶作去磷酸化处理后，用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。回收后的基因片段和质粒片段按实施例1步骤(2)中连接反应体系和反应条件进行连接，连接产物为pCW190(图4)。连接反应液按实施例1步骤(2)中方法转化感受态E.coli Top10。阳性菌(E.coli/pCW190)在表面涂有X-Gal的LB-Amp平板上长成蓝色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用Not I酶切进行鉴定。

[0064] (3)电转化用Lm感受态细胞的制备

[0065] 接种Lm于15ml含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基，37℃220rpm培养12～16h。吸取 12.5ml菌液至250ml含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基，37℃培养至A600为0.4左右(约 4h)，加入penicilLmn G(终浓度：12.5μg/ml)，继续培养至A600为0.7左右(约2.5h)。转移菌液于洁净、无菌、预冷的250ml聚丙烯离心管中，置冰浴20min。4℃离心10000r/min 5min，弃上清。加入100ml冰冷0.5mol/L蔗糖液重悬菌沉淀，于4℃离心10000r/min 5min，弃上清，再用
100ml冰冷0.5mol/L蔗糖液洗2次。加入2ml冰冷0.5mol/L蔗糖液重悬菌沉淀，分装预冷无菌EP管(50μl/管)，立即于-70℃保存备用。

[0066] (4)质粒pCW190电转化Lm

[0067] 从-70℃冰箱取出1支(3)步制备的Lm细胞放于冰上融化，用预冷枪头吸入在冰上预冷的重组质粒pCW190 5μl，用手指轻弹管底使液体混合均匀，置冰浴5min。用预冷枪头将EP 管内全部液体吸入放冰浴预冷的电击杯(间距0.1cm)样品槽中，放冰上5min。取出电击杯置于电转化仪内电击1次(电击参数为2KV，5ms)，立即取出电击杯放冰浴5min。加入750μl 于37℃预温的0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基于电击杯中，轻轻用枪头吹出样品槽内菌液并混匀，将电击杯内全部液体吸至无菌EP管中，于30℃140rpm振荡培养2h。将全部菌液滴于含红霉素1～5μg/ml，X-gal 20～60μg/ml的BHI琼脂平板(以下简称BHI-Ery-X-gal平板) 中央，用无菌L形玻棒将菌液涂布整个平板，于30℃培养48～72h，阳性菌(Lm/pCW190) 生长为蓝色菌落。

[0068] (5)Lm/pCW190双同源重组杂交培养

[0069] Lm/pCW190划线接种BHI-Ery-X-gal平板42℃培养48h，长出的蓝色菌落再划线接种 BHI-Ery-X-gal平板，于42℃培养48h。挑取蓝色菌落于2ml BHI液体培养基中，30℃220rpm 振荡培养24h，吸取10μl菌液再转种2ml BHI液体培养基中，30℃220rpm振荡培养
24h，重复上步(转种)4次。取100μl菌液用PBS作10倍稀释，取10-6稀释菌液涂布BHI-X-gal平板(含X-gal 20～60μg/ml的BHI琼脂平板)和BHI-Ery-X-gal平板，每个平板上涂布稀释菌液100μl。阳性菌落LmΔactAplcB-lacZ在BHI-X-gal平板上长成蓝色菌落，在BHI-Ery-X-gal 平板上不生长。

[0070] (6)PCR鉴定LmΔactAplcB-lacZ

[0071] 用通用型柱式基因组提取试剂盒抽提LmΔactAplcB-lacZ基因组DNA作为模板，PCR扩增鉴定其中有无actA、orfBAldh、Ery和lacZ基因片段，根据扩增结果对LmΔactAplcB-lacZ 的基因重组情况进行鉴定。

[0072] 扩增actA的反应体系为：10×ultra pfu buffer 2.5μl，4dNTPs(10mmol/L.种)0.5μl，如 SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，上游引物(10μmol/L)(Lm actA-f: 5’-GCTATAAATGAAGAG GCTTCAGG-3’)0.8μl，下游引物(10μmol/L)(Lm actA-r: 5’-CTCTTAAATCAGCT AGGCGATC-3’)0.8μl，细菌基因组DNA样品2.5μl，ultra pfu 0.25μl， ddH2O 17.65μl。反应循环条件为：94℃5min→(94℃30s，55℃30s，72℃30s)×30个循环→
72℃ 10min→4℃，扩增产物长度约950bp。

[0073] 扩增orfBAldh的反应体系为：10×ultra pfu buffer 2.5μl，4dNTPs(10mmol/L.种)0.5μl，如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，上游引物(10μmol/L)(Lm orfBAldh-f:5’- CTTCGATGACAACAGCTGTACC-3’)0.8μl，下游引物(10μmol/L)(Lm orfBAldh-r:5’- AATCCTAAAGCATGCGCCTTCG-3’)0.8μl，细菌基因组DNA样品2.5μl，ultra pfu 0.25μl， ddH2O 17.65μl。反应循环条件为：94℃5min→(94℃1min，57℃30s，72℃2min)×30个循环→72℃10min→4℃，扩增产物长度约1200bp。

[0074] 扩增Ery的反应体系为：10×ultra pfu buffer 2.5μl，4dNTPs(10mmol/L.种)0.5μl，如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，上游引物(10μmol/L)(Ery-f:5’- GTCGACGATTCACAAAAAATAGGC-3’)0.8μl，下游引物(10μmol/L)(Ery-r:5’- ACTAGTCCCGGGGCGAATTG-3’)0.8μl，细菌基因组DNA样品2.5μl，ultra pfu 0.25μl， ddH2O
17.65μl。反应循环条件为：94℃3min→(94℃30s，57℃30s，72℃2min)×30个循环→72℃
10min→4℃，扩增产物长度约1200bp。

[0075] 扩增lacZ的引物和反应体系和反应循环条件同步骤(1)，扩增产物长度约4000bp。

[0076] LmΔactAplcB-lacZ的PCR鉴定阳性结果图如图5。由图可见，经双同源杂交培养，lacZ 已整合入Lm基因组，细菌不携带Ery基因，且actA基因被敲除。

[0077] 实施例3：利用上述制备的重组质粒和重组菌，制备基因组携带外源基因(以间皮素基因HuMeso为例)的重组减毒单增李斯特菌

[0078] (1)间皮素基因片段合成

[0079] 从NCBI上查询间皮素蛋白基因，并在上游加入HindⅢ酶切位点，下游加入XhoⅠ酶切位点，然后根据李斯特菌密码子进行相应优化，最后通过合成直接获得DNA序列(以公司提供克隆质粒pUC57-Meso的形式获得)，序列长度为1781bp。

[0080] (2)构建打靶质粒

[0081] ①中间质粒pCW203-Meso的构建

[0082] 按照质粒说明书提取质粒pUC57-Meso和pCW203，以30μL Elution Buffer洗脱。

[0083] pUC57-Meso和pCW203用HindⅢ和XhoⅠ酶切。按照20μL体系：pUC57-Meso或pCW203 ＜1ng，HindⅢ1μL，XhoⅠ1μL，10×NEB Buffer 2μL，ddH2O将体系补足20μL。37℃水浴 1h酶切质粒，pCW203酶切后的片段需加0.5μL CIAP，37℃水浴30min去磷酸化。将酶切混合物与6×Loading Buffer混合，电泳(1％琼脂糖，94V)并胶回收相应长度的片段(pUC57-Meso 回收酶切后的小片段即间皮素基因片段，长度约为1781bp；pCW203回收酶切后的大片段即载体片段，长度约>10Kb)，以30μL Elution Buffer洗脱。

[0084] 分别取pUC57-Meso酶切后回收的间皮素基因片段(插入片段)与pCW203酶切后回收的载体片段，按照连接体系：载体50ng，插入片段摩尔数：载体片段摩尔数＝5:1，T4Ligase 1μL， 10Ligase Buffer 5μL，ddH2O将体系补足10μl，22℃连接1h。将连接产物按体积1:10与大肠杆菌DH5α的感受态细胞轻柔混匀，冰浴30min，42℃热击45s，冰浴3min，加入预热的SOB 肉汤500μL，混匀后于37℃，180rpm培养1h，涂布于LA平板(LB-Amp平板：含100μg/mL Amp的LB平板)，37℃培养16-20h。

[0085] PCR筛选：以煮沸法提取的细菌DNA基因组为模板，扩增目的条带间皮素，如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，上游引物MESO-f：5’-CCACAAGCTTTGTCCCGTACACTTG -3’，下游引物MESO-r：5’-TATACTCGAGAGCAAGTGTAGAAGC-3’，反应循环条件为：94℃ 3min→(94℃1min，47℃30s，72℃1min)×30个循环→72℃10min→4℃；电泳观察PCR 结果(电泳条件：
1％琼脂糖凝胶；90V，上样量：5μl PCR产物)，预期结果：间皮素片段约 1781bp。

[0086] 酶切验证：PCR筛选验证的阳性菌提取质粒，按照上述酶切体系以HindⅢ和XhoⅠ进行酶切，将酶切混合物与6×Loading Buffer混合进行电泳(1％琼脂糖，94V)。

[0087] 测序验证：提取PCR及酶切验证符合预期的质粒送测序公司测序。将测序验证后完全正确的携带阳性质粒的大肠杆菌保存于-80℃。

[0088] ②打靶质粒pCW180-Meso的构建

[0089] 提取质粒pCW180，以30μL Elution Buffer洗脱。将质粒pCW180及中间质粒 pCW203-Meso分别用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行酶切。酶切体系以20μl为例： pCW203-Meso或pCW180＜1ng，BamHⅠ1μL，XhoⅠ1μL，10×NEB Buffer 2μL，ddH2O 将体系补足20μL。37℃水浴1h酶切质粒，pCW180酶切后的片段需加0.5μL CIAP，37℃水浴30min去磷酸化。将酶切混合物与6×Loading Buffer混合，电泳(1％琼脂糖，94V)并胶回收相应长度的片段(pCW203-Meso回收酶切后的小片段，长度约1840bp；pCW180回收酶切后的大片段，长度约8621bp)，以30μL Elution Buffer洗脱。

[0090] pCW203-Meso用BamHⅠ和XhoⅠ酶切后回收的片段(插入片段)与pCW180酶切后回收的片段(载体片段)按照连接体系：载体50ng，插入片段摩尔数：载体片段摩尔数＝5:1， T4Ligase 1μL，10Ligase Buffer 5μL，ddH2O将体系补足10μl，22℃连接1h。连接产物按(2) ①的方法转入大肠杆菌DH5α，涂布于LA平板，对长出的单个菌落进行PCR筛选、BamHⅠ和XhoⅠ双酶切验证以及测序验证，PCR筛选方法同(2)①；BamHⅠ和XhoⅠ双酶切验证方法类似于(2)①，仅使用的酶和酶切体系不同；测序验证方法同(2)①。

[0091] (3)电转化用LmΔactAplcB-lacZ感受态细胞的制备方法同实施例2(3)。

[0092] (4)打靶质粒电转化LmΔactAplcB-lacZ

[0093] 从-70℃冰箱取出1支(3)步制备的LmΔactAplcB-lacZ感受态细胞放于冰上融化，按实施例2(4)的方法将(2)步制备的打靶质粒pCW180-Meso转入LmΔactAplcB-lacZ。将全部菌液滴于含红霉素1～5μg/ml，X-gal 20～60μg/ml的BHI琼脂平板(BHI-Ery-X-gal平板，以下简称BEXI平板)中央，用无菌L形玻棒将菌液涂布整个平板，于30℃培养48～72h，阳性菌 (LmΔactAplcB-lacZ/pCW180-Meso)生长为蓝色菌落。于BEXI平板上进行纯培养，30℃培养24h，进行提质粒及PCR验证。

[0094] 按照质粒提取试剂盒说明提取质粒(李斯特菌为革兰阳性菌，SolutionⅠ使用前需加入溶菌酶，溶菌酶终浓度为20mg/L，加入SolutionⅠ-溶菌酶后重悬，37℃水浴45min)，最后以30μl Elution Buffer洗脱后电泳。凝胶成像，观察有无条带以判断重组质粒导入是否成功，质粒大小为10455bp。

[0095] PCR验证：以煮沸法提取的细菌内全部DNA为模板，扩增目的条带间皮素，如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，上游引物MESO-f：5’-CCACAAGCTTTGTCCCGTACACTTG -3’，下游引物MESO-r：5’-TATACTCGAGAGCAAGTGTAGAAGC-3’，反应循环条件为：94℃ 3min→(94℃1min，47℃30s，72℃1min)×30个循环→72℃10min→4℃；电泳观察PCR结果(电泳条件：1％琼脂糖凝胶；90V，上样量：5μl PCR产物)，预期结果：间皮素片段约1781bp。

[0096] (5)LmΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组及筛选

[0097] ①LmΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组杂交培养

[0098] 将已电转入打靶质粒的LmΔactAplcB-lacZ划线接种BEXI板，42℃传代培养2-3代(每代培养时间为48小时)，挑取单个蓝色菌落接种5ml BHI肉汤，30℃，200rpm传代培养6代 (每代培养时间为24小时)。待传到肉汤第3代开始，每代取40μl培养物加入360μl BHI稀释106倍，分别涂布稀释菌液100μl于BEXI和BXI(含X-gal 20～60μg/ml的BHI琼脂平板) 平板，30℃培养24h。阳性菌落LmΔactAplcB-MESO在BXI平板上长成白色菌落(见图6)，在BEXI平板上不生长(见图7)。打靶质粒与LmΔactAplcB-lacZ同源重组过程见示意图(图 8)。

[0099] ②PCR鉴定LmΔactAplcB-MESO

[0100] 细菌基因组DNA提取试剂盒提取LmΔactAplcB-MESO的基因组DNA作为模板，进行以下三组基因片段的扩增：抗红霉素基因、靶抗原基因盒以及actA基因，根据扩增结果对重组菌LmΔactAplcB-MESO进行鉴定。LmΔactAplcB-MESO扩增间皮素，其引物及反应条件同(2) ①，扩增目的条带抗红霉素基因Ery，约1471bp，引物如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，Ery-f/r(f:5’-GATAAGTCGACGATTCACAAAAAATAG-3’，r:5’-AAAACTAGTCCCGGG GCGAATTG-3’)，反应循环条件为：94℃3min→(94℃1min，60℃30s，72℃2min)×30个循环→72℃10min→4℃；扩增Lm actA基因，约950bp，如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，引物Lm-actA-f/r(f:5’-GCTATAAATGAAGAGGCTTCAGG-3’，r: 5’-CTCTTAAATCAGCTAGGCGATC-3’)，反应循环条件为：94℃3min→(94℃1min，50℃30s， 72℃1min)×30个循环→72℃10min→4℃。经PCR鉴定，LmΔactAplcB-MESO携带有间皮素基因，不携带抗红霉素基因，且actA基因被敲除。鉴定结果与预期吻合，LmΔactAplcB-MESO 制备成功。

[0101] ③基因测序验证

[0102] PCR鉴定后以细菌基因组DNA作为模板，PCR扩增靶抗原基因间皮素，对扩增产物测序验证，对测序正确的菌株进行菌种保存。

[0103] 实施例4：基因组携带外源基因(以间皮素基因为例)的重组减毒单增李斯特菌对动物的毒力测定

[0104] (1)重组减毒单增李斯特菌对小鼠的LD50与单增李斯特菌菌野生株的对比

[0105] 重组减毒单增李斯特菌和单增李斯特菌菌野生株的BHI液体培养基新鲜培养物，用生理盐水配制成不同的浓度(野生株配成：5×105、5×106、5×107CFU/ml，减毒株配成：58 8 9
×10、 8×10 、1.2×10 CFU/ml)。C57BL/6小鼠随机分组，剪耳朵标记，适应性饲养1周；
75％酒精消毒小鼠尾部皮肤，尾静脉缓慢注射上述不同浓度的不同菌悬液100μl，连续观察和记录小鼠死亡情况和体重10d；采用改良寇氏法计算菌株对C57BL/6小鼠的LD50，得到野生株静脉接种小鼠后的LD50为4.0×105CFU/只，减毒株静脉接种小鼠后的LD50为7.8×
7
10 CFU/只，接种不同剂量的两株菌的小鼠的生存曲线见图9。由此结果可见，细菌actA和plcB基因的敲除导致其毒力显著降低，即得到了显著减毒的效果。

[0106] (2)重组减毒单增李斯特菌对小鼠重要器官的病理损伤与单增李斯特菌菌野生株的对比

[0107] 重组减毒单增李斯特菌和单增李斯特菌菌野生株的BHI液体培养基新鲜培养物，用生理盐水配制成不同的浓度(野生株配成：4×105CFU/ml，减毒株配成：7.8×107CFU/ml)。C57BL/6 小鼠随机分组，剪耳朵标记，适应性饲养1周；75％酒精消毒小鼠尾部皮肤，尾静脉缓慢注射上述菌悬液100μl，接种后观察小鼠一般情况，于接种后第3天处死小鼠，收集小鼠肝脏和脾脏浸泡于4％多聚甲醛中固定24h，石蜡包埋和切片，制作HE染色病理标本片，将病理切片置于显微镜下，观察组织切片和采集图像，结果见图10。从图10可见，减毒菌株在接种菌量更大的情况下在相同时间内引起的病理损伤更轻，表现了更低的毒性。

[0108] 实施例5：基因组携带外源基因(以间皮素基因为例)的重组减毒单增李斯特菌诱导的抗原特异性细胞免疫应答与携带相同基因的重组减毒绵羊李斯特菌的对比

[0109] (1)菌株配制和免疫小鼠

[0110] 6～8周龄的C57BL/6雌鼠适应性喂养3d后，随机分组，一组尾静脉免疫重组携带间皮素基因的重组减毒绵羊李斯特菌(LiΔactAplcB-MESO)(免疫剂量：2×107CFU)，一组尾静脉免疫携带间皮素基因的重组减毒单增李斯特菌(LmΔactAplcB-MESO)(免疫剂量： 7.8×106CFU)。LmΔactAplcB-MESO和LiΔactAplcB-MESO的BHI液体培养基新鲜培养物，用生7 8
理盐水配制成不同的浓度(单增配成：7.8×10CFU/ml，绵羊配成2×10CFU/ml)。按照分组经小鼠尾静脉注射100μl菌液，从接种之日起，每天测量小鼠体重至接种之日起第9天。

[0111] (2)流式细胞术检测抗原特异性分泌IFN-γ细胞因子的CD4+和CD8+T淋巴细胞比率

[0112] 脾细胞悬液制备：小鼠免疫后第9天，颈椎脱臼处死小鼠，无菌操作取脾脏，放于装有 1ml RPMI Medium 1640(含1％双抗)的5ml离心管中，置冰浴备用。加5ml RPMI Medium 1640 (含1％双抗)于一灭菌平板，其中放一张无菌200目尼龙膜，用无菌眼科镊取脾脏放于尼龙膜上，并用尼龙膜将脾脏包裹，用无菌研棒轻研脾脏至其泛白(脾细胞脱落后剩下的被膜及未剔除干净的结缔组织)，用枪头将所有脾细胞悬液收集至灭菌15ml EP离心管。

[0113] 红细胞裂解：将装有脾细胞悬液的离心管放入低温离心机中，1300rpm/min，4℃离心5min，弃去上清，震荡离心管，使沉淀在离心管底部的细胞分散，向离心管中加入4ml经过滤除菌的红细胞裂解液，上下颠倒离心管，使细胞与红细胞裂解液充分接触，静置5min后，立即加入4ml RPMI 1640Medium(含1％双抗)终止裂红反应，1300rpm/min 4℃离心5min，弃去上清，震荡离心管，向离心管中加入5ml RPMI 1640Medium(含1％双抗)，上下颠倒离心管以洗去残余的红细胞裂解液，1300rpm/min，4℃离心5min，弃去上清，震荡离心管，重复洗涤一次。震荡离心管后，向离心管中加入2ml RPMI 1640Medium(含10％胎牛血清)重悬，将离心管置于冰上，备用。

[0114] 刺激物配制：1.gp33-41储备液：1mg的肽段中加入1ml DMSO，配制成1mg/ml的储备液，10μl/支分装EP管，储存于-20℃冰箱中，避免反复冻融；2.gp61-80储备液：1mg的肽段中加入1ml DMSO，配制成1mg/ml的储备液，10μl/支分装EP管，储存于-20℃冰箱中，避免反复冻融；3.流式PMA储备液：0.1mg的PMA中加入1ml DMSO，配制成0.1mg/ml的储配液，10μl/支分装EP管，储存于-20℃冰箱中，避免反复冻融；4.流式Ionomycine储备液： 1mg的Ionomycine中加入1ml DMSO，配制成1mg/ml的储备液，10μl/支分装EP管，储存于 -20℃冰箱中，避免反复冻融；5.流式阳性刺激混合液：吸取100μl RPMI 1640Medium(含 10％胎牛血清)、0.2μl Golgi Stop、0.2μl Ionomycine储备液和0.2μl PMA储备液于EP管，用枪头吹打混合均匀；6.流式实验刺激混合液：吸取100μl RPMI 1640Medium(含10％胎牛血清)、0.2μl gp33-41储备液、0.2μl gp61-80储备液和0.2μl Golgi Stop于EP管中，用枪头吹打混合均匀。

[0115] 刺激：每个样品同时做阴性对照(不刺激)和实验处理(GP33、GP61肽段)2个孔；各组随机选取2个样品用阳性刺激物(PMA+Ionomycine)刺激作为阳性质控。于96孔板中，每孔加入50μl脾细胞悬液和50μl相应刺激物，5％CO2培养箱37℃刺激5h。

[0116] 表面抗体染色：刺激完毕后，将96孔板取出，4℃1300rpm/min离心5min，弃上清，将 96孔板置于漩涡震荡仪上震荡，使得沉淀于板底的细胞分散，于避光处将表面抗体Anti-Mouse CD8a PE、Anti-Mouse TCR beta PerCP-Cyanine5.5、Anti-Human/Mouse CD44FITC、Anti-Mouse IFN gamma APC用PBS(含体积浓度2％胎牛血清)在灭菌EP管中分别按照体积稀释为1:200 (V:V)。每孔加入50μl表面抗体混合液重悬，4℃避光孵育30min后，于避光向每孔细胞中加入150μl PBS(含体积浓度2％胎牛血清)终止孵育，1300rpm/min 4℃离心
5min，甩弃上清，震荡96孔板，加200μl PBS(含2％胎牛血清)重悬，洗去残余抗体，1300rpm/min 4℃离心5min，甩弃上清，震荡96孔板。

[0117] 破膜：每孔加入100μl Cytofix/Cytoperm重悬，4℃避光静置20min后避光加入100μl Buffer Perm/Wash终止，1300rpm/min 4℃离心5min，甩弃上清，震荡96孔板，每孔加200μl Buffer Perm/Wash重悬洗涤，1300rpm/min 4℃离心5min，甩弃上清，震荡96孔板。

[0118] 胞内抗体染色：于避光处用1×perm/wash buffer在灭菌EP管中将抗体Anti-Mouse IFN gamma APC按1:200体积比稀释。每孔分别加入混合抗体50μl重悬，4℃避光孵育45min后，于避光向每孔细胞中加入150μl 1×perm/wash buffer终止孵育，1300rpm/min 4℃离心5min，甩弃上清震荡96孔板，加200μl 1×perm/wash buffer重悬，洗去残余抗体，
1300rpm/min 4℃离心5min，甩弃上清，每孔细胞加入200μl 2％多聚甲醛溶液重悬收集，4℃避光保存准备上机。

[0119] 上机检测结果：用Research Beads进行Performance QC以校正光路和流路，去离子水为样品冲洗流式仪约10min，至Threshold Rate在20evts/sec以下。调试上机参数，选取所使用的荧光，确定样品收取数(106events)，用空白孔(不做任何处理的细胞)调节测试电压，使 FSC A-FSC H散点图、FSC A-SSC A散点图中细胞群与横坐标轴呈约45°夹角，每一种染料在峰状图中的出峰值(阴性峰峰值)均小于102；测定样品并进一步调节电压，使分析某种荧光染料孵育的细胞时，该荧光染料的双峰峰值(阴性峰峰值、阳性峰峰值)以102为界，其余荧光染料峰值小于102。用Flowjo对结果进行分析。结果见图11。

[0120] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

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细菌毒力因子及其用途-专利编号CN101711861A	2020-05-13	485
细菌毒力基因-专利编号CN1735689A	2020-05-11	1127
捕食螨毒力测定方法-专利编号CN104165972A	2020-05-12	664
捕食螨毒力测定方法-专利编号CN104165972B	2020-05-11	951
降低细菌的毒力的方法-专利编号CN102883602A	2020-05-11	946
细菌毒力因子及其用途-专利编号CN1922324B	2020-05-13	739
降低细菌的毒力的方法-专利编号CN102883602B	2020-05-12	966
细菌毒力因子及其用途-专利编号CN1922324A	2020-05-12	224
叶螨毒力测定实验装置-专利编号CN108469497A	2020-05-11	274
捕食螨毒力测定装置-专利编号CN204154697U	2020-05-13	1040

一种基因组携带外源基因的减毒重组单增李斯特菌及制备方法

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