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一种抗李斯特菌的三萜化合物及用途

阅读：223发布：2021-02-28

IPRDB可以提供一种抗李斯特菌的三萜化合物及用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种抗李斯特菌的三萜化合物及用途。通过红细胞溶血试验，免疫印迹试验及小鼠巨噬细胞(J774)炎症试验，说明三萜化合物积雪草酸，在抗李斯特菌的感染方面有显著的效果，具体是抑制李斯特菌的毒力因子LLO，因此积雪草酸可以用于新药物的研发。，下面是一种抗李斯特菌的三萜化合物及用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种三萜化合物积雪草酸，其特征在于：可以抑制李斯特菌的毒力因子LLO的溶血活性。

2.根据权利要求1所述的积雪草酸，其特征在于：可以抑制李斯特菌中毒力因子LLO的表达。

3.根据权利要求1所述的积雪草酸，其特征在于：可以抑制小鼠巨噬细胞的炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达。

4.根据权利要求1所述的三萜化合物积雪草酸，其特征在于：在医药生产、药物研发中的应用。

说明书全文

一种抗李斯特菌的三萜化合物及用途

技术领域

[0001] 本发明涉及抗李斯特菌毒力因子LLO的三萜化合物，具体是能抑制其毒力因子LLO的表达，为新药物的研发提供先导化合物，属于医药领域。

背景技术

[0002] 上世纪90年代，世界卫生组织将李斯特菌列为四大食源性病原菌之一，是一种能产生溶血素的外毒素。李斯特菌病虽然发病率低，但致死率高达33％。根据全球疫情报告系统显示，从1996年到2018年，由李斯特菌感染引起的疾病，在27个国家共暴发91次和29次召回事件。

[0003] 本论文研究的积雪草酸是从双子叶伞形科热带药用植物积雪草中提取而来，属于三萜化合物，具有抑制癌细胞增殖、抗炎、抗肿瘤等多种药理学作用。近年来，尽管抗生素能有效的治疗食源性疾病，但迫于在临床中过度使用药物及在畜牧业中大量使用生长促进剂的选择压力，大大推动了细菌向耐药性方向进化的速度。目前氨苄青霉素作为我国治疗该病的首选用药，耐药性却是在逐年增高,到2005年耐药性已经达到78.33％，导致多种抗菌药物治疗效果不显著，无疑给临床治疗该病带来了一定困难。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种三萜化合物，以抑制李斯特菌的毒力因子，解决上述背景技术中存在的问题。

[0005] 本发明所述的三萜化合物为积雪草酸，可以抑制李斯特菌毒力因子LLO的溶血活性。

[0006] 本发明所述积雪草酸，具体是一种能抑制李斯特菌毒力因子LLO表达的化合物。

[0007] 本发明提供的积雪草酸，可以抑制小鼠巨噬细胞的炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达。

[0008] 本发明的另一个目的是提供上述三萜化合物积雪草酸的用途。

[0009] 所述三萜化合物在医药生产、药物研发中的应用。

附图说明

[0010] 图1：积雪草酸对LLO溶血活性的影响(横坐标为积雪草酸浓度，纵坐标为血红蛋白含量)

[0011] 图2：积雪草酸对李斯特菌培养物上清LLO表达量的影响(积雪草酸浓度依次为0、4μ g/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml)

[0012] 图3：积雪草酸对细胞炎症因子TNTF-α的影响

[0013] 图4：积雪草酸对细胞炎症因子IL-6的影响

[0014] 图5：积雪草酸对细胞炎症因子IL-1β的影响

具体实施方式

[0015] 1.三萜化合物积雪草酸抑制李斯特菌的溶血活性

[0016] 加入485μl羊血，用PBS将体积补齐至500μl，3000rad/s条件下离心2min，缓慢吸去上清后，再次用PBS补齐至500μl。反复洗涤上清至透明，弃上清。

[0017] 设置不加药组及加药组，浓度依次为0、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml及32μg/ml，向离心管中加入485μl PBS及1μl纯化后的LLO，除不加药组之外，依次加入不同浓度的积雪草酸，混匀后，置于恒温培养箱内孵育20min，加入12.5μl红细胞，上下颠倒5-6次混匀，置于培养箱继续孵育10min后，12000rad/s条件下离心2min后，取上清200μl于OD 570 nm处测量吸光度，收集数据，绘图。

[0018] 结果见图1

[0019] 2.三萜化合物积雪草酸抑制李斯特菌LLO的表达

[0020] 挑李斯特菌的单菌落，接入2ml的BHY锥形瓶中，置于摇床过夜培养，待菌液生长至对数生长期后，调整菌液浓度至1×108后，分装至5个试管中，每个试管内2ml菌液。分别向离心管中加入不同浓度的积雪草酸，其中包括对照组，积雪草酸的浓度依次为4μg/ml、8 μg/ml、16μg/ml及32μg/ml，继续培养5h，此时OD600nm处测光密度值约为2.0左右，将菌液移入2ml离心管中，于4℃12000rad/s离心10min，弃沉淀，收集菌液上清，测OD 值，进行定量分析，加入适量的蛋白上样缓冲液，混匀后置于100℃金属浴中加热12min，恢复至室温后，吸取15μl样品及5μl Marker进行加样，设置电泳条件为恒压80V 30min，120V 60min进行电泳。电泳结束后，根据Marker指示作用，测量目标蛋白所在胶的大小后，根据凝胶大小剪两块垫板和PVDF膜。在转膜仪上依次准确放置垫板、PVDF膜、胶、垫板，盖上仪器，设置条件为恒流转膜100mA，1h。结束后，放入封闭液中封闭2h。将膜与LLO抗体共孵育2h。用TBST在摇床上洗三次，每次10min，将膜与山羊兔二抗结合，室温下孵育1h。用TBST再次洗三次，每次10min，配制显影液，进行显影。

[0021] 结果见图2

[0022] 3.三萜化合物积雪草酸抑制小鼠巨噬细胞的炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达[0023] 实验设计为空白组及加药组(药物浓度依次为4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml)。挑取李斯特菌的单菌落于BHY中，置于摇床过夜培养，第二天12000rad/s，4℃离心10min，弃上清收集菌体沉淀。用无双抗DMEM完全培养基调整菌液浓度，在OD600nm下测量值为 0.1左右即可。

[0024] 将J774细胞置于10％胎牛血清、100mg/ml链霉素和100mg/ml青霉素的高糖细胞培养基中，37℃，5％CO2的培养条件培养，当细胞生长至培养瓶的90％时，用0.25％胰酶进行消化、离心、重悬、计数处理后，接种1ml细胞悬液于24孔无菌细胞培养板中并在37℃恒温培养箱中培养过夜。弃去过夜培养细胞的培养液，每孔加入1ml上述制备好的菌体悬液，除不加药组外，其余均按照上述药物浓度依次加入，于37℃恒温培养箱中培养5h后，将培养上清转移至2ml离心管中，4℃、12000rad/s条件下离心5min，将上清移至干净的2ml离心管中， -20℃储存备用。

[0025] 吸取100μl稀释后的包被液分别加入到ELISA板中，每个样品一列，共三行，依次为TNF- α、IL-6和IL-1β，包被过夜，第二天弃去包被液，加入250μl PBST洗三次，每次振荡洗涤 2min，每孔依次加入200μl样品稀释液，振荡5min后，置于室温1h。弃去样品稀释液，用PBST洗涤3次，每次2min，分别加入100μl离心后的待检测的样品上清，室温放置孵育 2h后，加入250μl PBST洗涤3次，每次2min，每孔加入100μl已稀释的HRP标记的二抗，室温振荡30min，加入250μl PBST洗涤3次，每次2min，在避光处每孔加入TMB底物液100 μl，避光静置
15min后，加50μl稀硫酸终止液，用酶标仪在450nm处检测读取数值，绘图。

[0026] 结果见图3图4图5。

标题	发布/更新时间	阅读量
细菌毒力因子及其用途-专利编号CN101711861A	2020-05-13	485
细菌毒力基因-专利编号CN1735689A	2020-05-11	1127
捕食螨毒力测定方法-专利编号CN104165972A	2020-05-12	664
捕食螨毒力测定方法-专利编号CN104165972B	2020-05-11	951
降低细菌的毒力的方法-专利编号CN102883602A	2020-05-11	946
细菌毒力因子及其用途-专利编号CN1922324B	2020-05-13	739
降低细菌的毒力的方法-专利编号CN102883602B	2020-05-12	966
细菌毒力因子及其用途-专利编号CN1922324A	2020-05-12	224
叶螨毒力测定实验装置-专利编号CN108469497A	2020-05-11	274
捕食螨毒力测定装置-专利编号CN204154697U	2020-05-13	1040

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